[发明专利]一种利用发夹引物进行多重PCR的方法

说明书

本发明涉及一种利用发夹引物进行多重PCR的方法和试剂盒、以及在建立二代测序平台文库中的应用。发夹引物3’端特异序列与目标区段完全配对，解链温度在80℃以上，在PCR反应时只在变性程序中打开发夹结构。可以有效减少非特异扩增和引物二聚体的形成，提高多重PCR产物的均一性。本发明还利用多重发夹引物进行两轮PCR反应快速方便地构建二代测序文库，并通过携带不同条形码序列的接头引物以区分不同模板，而不同的接头引物携带相同的通用扩增引物，以减少不同模板扩增产物的差异。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，特别是涉及一种利用发夹引物进行多重PCR并对多个样本目标区段DNA序列进行富集，并减少引物二聚体和非特异扩增的多重PCR技术。

背景技术

由于低廉的价格和简便的操作，多重PCR是目标区段富集技术的重要手段。面对大量复杂基因组样本的目标区段捕获，多重PCR技术由于特异性强、价格低、重复性好等优点，已成为首选技术。与此同时，商业化的多重PCR试剂盒和非商业化的多重PCR技术不断涌现。根据文献“Target-enrichment strategies for next-generation sequencing”(Naturemethods,2010,2010,7(2):111-118)和“Genotyping‐in‐Thousands by sequencing(GT‐seq):A cost effective SNP genotyping method based on custom ampliconsequencing”(Molecular ecology resources,2015,15(4):855-867)报道，Thermo FisherScientific和illumina等供应商提供针对肿瘤检测的商业化多重PCR试剂盒；非商业化技术也有长片段PCR、微液滴PCR、补丁PCR等。

与其他目标区段富集技术相比，多重PCR的特异性强、价格低廉、不需要昂贵的硬件设施。但是传统多重PCR的通量受到引物对数的限制。在传统多重PCR反应中，随着引物对数的增加，引物错配和非特异扩增产物会急剧增加。多对引物间的相互作用，不但引入了大量非特异扩增产物，还导致不同目标片段的拷贝数差异巨大；所以传统多重PCR一般被限制为10-20对引物扩增，超过该限制则无法得到均一的产物。如何优化多重PCR反应条件，减少引物二聚体、引物错配和非特异扩增是增加多重PCR通量的关键因素，近些年有一些多重PCR优化策略被报道，但仍有待进一步提高。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用发夹引物进行多重PCR的方法，提升多重PCR通量，同时克服传统多重PCR技术中因多对引物产生错配、非特异性扩增导致目标产物不均一的缺陷。

技术方案

本发明的第一个方面是提供一种利用发夹引物进行多重PCR的方法，其中，与目标区段序列特异性配对的引物是发夹引物。优选地，所说发夹引物的3’端与目标区段序列特异性配对，发夹引物的5’端与3’端序列配对。更加优选地，所说的发夹引物3’末端的碱基与5’末端的碱基互补配对，以使所说的发夹引物5’末端和3’末端封闭。

如本发明所述，“发夹引物”指具备“发夹结构”或称“茎环结构”的引物。作为一种优选的实施方式，发夹引物的3’端有约20bp的目标区段特异序列，5’端序列与3’端序列互补配对，形成茎部。其余部分为环部。除非特别指明，发夹引物指上游和下游均为发夹结构的一对引物。优选地，在同一PCR反应中所述的上下游发夹引物数为两对或者两对以上。