[发明专利]一种获取rDNA ITS2序列用来对铁皮枫斗鉴定的方法

说明书

本发明公开了一种获取rDNA ITS2序列用来对铁皮枫斗进行鉴定的方法，提供了用于铁皮枫斗鉴定的标准序列，可有效解决铁皮枫斗药材分子鉴定问题。具体步骤如下：(1)设计两对引物对ITS2序列分段进行PCR扩增；(2)对扩增结果测序后，按重叠区域连接在一起，获得ITS2序列；(3)与本发明标准序列SEQ ID No.1比对，序列相似性大于或等于99％，则鉴定为铁皮石斛。本发明能够实现铁皮枫斗药材、基原植物、种子种苗等的快速、准确鉴定。

技术领域

本发明涉及术语中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及利用核糖体DNA(rDNA)ITS2片段快速鉴别铁皮枫斗的方法及其应用。

背景技术

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo(《中国植物志》英文版eflora中拉丁名为Dendrobium catenatum Lindley)为兰科珍稀名贵药用植物，有“中华九大仙草之首”之盛名。铁皮石斛对生长环境条件要求苛刻，其自然繁殖能力低，生长缓慢，又经长期采挖，自然资源濒临枯竭，被列为国家重点保护的药材品种。铁皮枫斗是由铁皮石斛鲜条加工而成，已被公认为高端养生品。目前，我国药用石斛约有40余种，近年来铁皮石斛价格不断攀升，市场上把石斛属其他植物或兰科某些植物也作为铁皮石斛混入商品流通和临床应用，对铁皮石斛的临床疗效和用药安全产生了很多不良影响。DNA条形码技术依赖样品自身的基因分子信息，能够实现物种的准确鉴定。目前该技术在铁皮枫斗的鉴定中有以下问题：(1)铁皮石斛加工成铁皮枫斗的过程中，多进行高温加热进行加工，且时间较长，造成样品DNA的严重降解，影响DNA的提取效率；(2)通用引物ITS2F/3R在铁皮枫斗ITS2序列扩增中，扩增效率低。针对以上问题，本发明提供了一种获取rDNA ITS2序列用来对铁皮枫斗进行鉴定的方法。

发明内容

本发明第一个目的在于提供获取铁皮枫斗rDNA ITS2序列的PCR扩增策略、PCR扩增特异引物和体系配比。

本发明第二个目的在于提供鉴别铁皮枫斗的鉴定方法。

本发明提供的铁皮枫斗rDNA ITS2序列制备方法主要包括如下步骤：

(1)扩增策略：由于铁皮枫斗DNA降解较严重，故对铁皮枫斗ITS2序列进行分段扩增，即设计两对引物DO-2F/DO-2R和DO-3F/DO-3R分别扩增更短的序列，保证扩增的成功率，将DO-2F/DO-2R和DO-3F/DO-3R获得序列按重叠部分连接起来即得ITS2序列。

(2)PCR扩增特异引物：

用于铁皮枫斗ITS2序列分段扩增的引物为：

正向DO-2F：5’-GCATGGTGGCTCCTCGTG-3’；

反向DO-2R：5’-ATGGATTGGGATCACCTAAAA-3’；

按以下程序扩增：95℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 45s，40个循环；72℃ 10min；

正向DO-3F：5’-AAAGGCCTATGCTATTGTGA-3’；

反向DO-3R：5’-CGCTTATTGATATGCTTAAACTC-3’；

按以下程序扩增：95℃ 5min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 45s，40个循环；72℃ 10min。

(3)PCR扩增体系配比：