[发明专利]一种农杆菌介导的黑附球菌遗传转化方法及转化子菌株

权利要求书

1.一种农杆菌介导的黑附球菌遗传转化方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1）菌株、质粒

a) 黑附球菌野生菌株H5，已于2014年10月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 9713；

b) pKHt质粒带有潮霉素B磷酸转移酶基因 Hph，Hph 作为随机插入突变体的筛选标记基因；

2）原生质体制备

a) 从黑附球菌H5试管斜面挑取菌丝，接种至PDA平板，25℃培养5天后在其边缘打孔，接种于PD液体培养基，170 rpm、25℃摇培3天，过滤收集菌丝，用无菌滤纸吸干；

b) 用20 mL 0.6 mol/L甘露醇溶液配制的1%～2%的裂解酶悬浮菌丝体，30℃、80 rpm酶解3 h；

c) 4层灭菌擦镜纸过滤，用0.6 mol/L甘露醇冲洗，收集滤液，1500 rpm离心5 min；

d) MMC缓冲液重悬，洗2次；

e) 弃上清，用MMC缓冲液将原生质体沉淀重悬，并以MMC:PTC=3:1的比例加PTC缓冲液稀释，调原生质体终浓度至3×10⁷～3×10⁸ 个/mL，冰上放置待用；

3）原生质体对潮霉素抗性浓度的筛选

a) 融化PDA培养基，待温度降为50℃左右时，加入一定体积的潮霉素溶液制备含潮霉素的平板，终浓度分别为 0、10、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL，冷却备用；

b) 用无菌玻璃棒将步骤2）制备好的原生质体悬液轻轻涂布在含不同浓度潮霉素的PDA平板表面，25℃恒温培养箱中避光培养；

c) 每天观察并记录原生质体的再生情况；

4）农杆菌的转化和培养

a) 采用冻融法将质粒pKHt转化到农杆菌AGL-1；

b) 将含有目的质粒的农杆菌在含50 μg/mL卡那霉素和100 μg/mL利福平的LB平板上划线，挑取单菌落接种于LB液体培养基中, 180 rpm、28℃过夜培养至OD₆₀₀ 0.5～0.8，离心，MES溶液重悬，50 rpm摇培1～3 h；

5）黑附球菌原生质体转化

a) 将制备好的农杆菌和原生质体按照1:1～100:1比例混合，均匀涂在铺有纤维素尼龙膜的IM诱导培养基上，25℃光照培养箱培养24 h～72 h；

b) 待膜上长出小菌丝，将膜转移至含25、50、100、150 μg/mL潮霉素和300 μg/mL头孢霉素的PDA平板；

e) 待转化子长成菌落，转接到含药平板上，进行下一步验证；

6）转化子验证

a) 利用CTAB法从步骤5）取得的转化子中提取DNA，以 Hph 基因全长扩增引物hygbF/hygbR验证转化子；

b) 以引物ProbF/ProbR扩增504 bp的 Hph 基因片段作为探针，采用Roche公司地高辛标记试剂盒进行Southern杂交验证；

7）转化子遗传稳定性分析

a) 随机挑选20个抗潮霉素转化子，转接到含50 μg/mL潮霉素的PDA平板上，25℃培养3天；

b)从菌落边缘挑取菌碟到新的PDA平板上，重复上述培养过程4次，最后一轮转接后挑取菌碟接到含50 μg/mL潮霉素的PDA平板上，25℃培养，若能生长则说明该转化子稳定，反之则表明该菌株不具有遗传稳定性；以黑附球菌野生型菌株H5为对照。

2.权利要求1所述方法获得的转化子菌株 H5-5，其菌种保藏编号为CGMCC NO.12874。

3.权利要求2所述的菌株 H5-5在防治果蔬采后病害中的应用。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述的采后病害为由镰刀菌（Fusarium sp.）、灰霉菌（Botrytis sp.）等真菌引起的果蔬灰霉病、腐败病等。

5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述的采后病害为番茄灰霉病、莲蓬腐烂病、辣椒灰霉病等。