[发明专利]一种农杆菌介导的黑附球菌遗传转化方法及转化子菌株

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用潮霉素为筛选标记的农杆菌介导的黑附球菌遗传转化方法，及产生的转化子菌株。

背景介绍

目前，我国每年约有8000万吨的果蔬腐烂，造成近800亿元的经济损失。因此，通过发展贮藏或防腐技术以延长或保持果蔬品质，已成为重要的食品研究课题。利用生防菌对病原菌的拮抗作用控制果蔬采后病害，具有绿色和安全的优点，是当前果蔬储藏与保鲜行业的研究热点。

黑附球菌（Epicoccumnigrum）H5菌株是由本研究团队筛选的一株生防真菌，其次级代谢产物对镰刀属（Fusarium. spp）、灰霉属（Botrytis cinerea）及链格孢属（Alternaria. spp）等果蔬采后常见病原真菌有较强拮抗作用，该菌株已于2014年10月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏登记号CGMCC 9713）。黑附球菌H5能够在植物组织表面迅速产生抗真菌的化合物，显著控制采后真菌病害的发生，因此是一种防治农作物病害较为理想的生防菌。生防菌次级代谢产物对病原菌有强烈的抑制作用，但大多数野生型生防菌株生活力一般，在发酵液中累积目的发酵产物的能力很差，同时还会形成很多影响防效的副产物。因此，通过基因工程技术提高活性成分产量、减少副产物产生，从而提高其生防效果对于实际应用具有重要意义。但目前尚未建立黑附球菌的遗传转化体系，无法对其进行基因改造。

发明内容

本发明目的在于填补目前黑附球菌遗传转化方法的技术空白，提供一套完整的农杆菌介导的原生质体制备及遗传转化的方法，并提供一株制备的转化子菌株H5-5，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，分类命名为黑附球菌（Epicoccum nigrum），菌种保藏编号为CGMCC NO.12874，保藏日期为2016年8月22日。转化子菌株H5-5可用于防治果蔬采后病害，所述采后病害包括但不限于由镰刀菌镰刀属（Fusarium. spp）、灰霉属（Botrytis cinerea）等真菌引起的果蔬灰霉病、腐败病等，如番茄灰霉病、莲蓬腐烂病、辣椒灰霉病等。

本发明提供的转化子菌株H5-5的主要生物学特征为：在PDA培养基上生长时有气生菌丝，菌落呈土黄色，边缘不规则，有V形分支；分生孢子单生，球形或梨形，一般多胞，深金黄褐色，老熟后颜色变深，通常成熟孢子直径15～25μm，有时可达50μm。

本发明提供的农杆菌介导的黑附球菌遗传转化方法利用潮霉素抗性基因Hph为筛选标记，包括以下步骤：1) 黑附球菌原生质体的制备；2) 农杆菌的转化和培养；3)遗传转化体系的建立；4)转化子验证与转化效率分析；5)遗传稳定性测定。

进一步的，具体包括以下步骤：

1）菌株、质粒、培养基

黑附球菌（Epicoccum nigrum）野生菌株H5，已于2014年10月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 9713；

pKHt质粒带有潮霉素B磷酸转移酶基因（Hph），Hph作为随机插入突变体的筛选标记基因；

2）原生质体制备

a) 从黑附球菌H5试管斜面挑取菌丝，接种至PDA平板，25℃培养5天后在其边缘打孔，接种于PD液体培养基，170 rpm、25℃摇培3天，过滤收集菌丝，用无菌滤纸吸干；

b) 用20 mL 0.6 mol/L甘露醇溶液配制的1%～2%的裂解酶悬浮菌丝体，30℃、80 rpm酶解1～3 h；

c) 4层灭菌擦镜纸过滤，用0.6 mol/L甘露醇冲洗，收集滤液，1500 rpm离心5 min；

d) MMC缓冲液重悬，洗2 次；

e) 弃上清，用MMC缓冲液将原生质体沉淀重悬，并以MMC:PTC=3:1的比例加PTC缓冲液稀释，调原生质体终浓度至3×10⁷～3×10⁸ 个/mL，冰上放置待用；

3）原生质体对潮霉素抗性浓度的筛选

a) 融化PDA培养基，待温度降为 50℃左右时，加入一定体积的潮霉素溶液制备含潮霉素的平板，终浓度分别为 0、10、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL，冷却备用；