[发明专利]血液中循环肿瘤细胞的检测方法

权利要求书

1.一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法，其特征是：按如下步骤依次实施：

a. 全血处理：

向2mL全血中加入200μL的红细胞裂解液，室温放置15min，放置期间均匀摇晃；

200RCF下离心5min，吸除上清液，保留细胞；

向离心管中加入2mL、质量百分比浓度为1%的FPBS溶液，FPBS即血纤蛋白原结合蛋白，混匀后于200RCF下离心5min，去除上清液；FPBS溶液的体积配比为：FBS:PBS=1:99，FBS全称fetal bovine serum，即胎牛血清，PBS全称Phosphate Buffered Saline，即磷酸盐缓冲液；

b. 细胞全富集：

加入1mL的FPBS溶液，混合均匀后转入用APTES处理的培养皿中，APTES即3-氨丙基三乙氧基硅烷，分子式H₂NCH₂CH₂CH₂Si(OC₂H₅)₃，将培养皿置于37℃摇床中培养45min；

培养后将培养皿置于4℃环境中静置10min；

c. 细胞固定：

吸除FPBS，向培养皿中加入质量百分比浓度为4%甲醛溶液后置于4℃环境中静置10min；

吸除甲醛，加入1mL甲醇，置于-20℃环境中静置10min；

吸除甲醇，用2mL的PBS清洗三次；

d. 封闭及抗体孵育：

向培养皿中加入1mL用PBS配制的封闭液，在4℃环境下避光孵育1hour；

封闭液的配制方法是：首先用PBS配置浓度为5%(m/V)的脱脂奶粉，然后向脱脂奶粉中加入Tween-20使Tween-20的浓度为0.02%(V/V)，即为封闭液，m/V指溶质质量/溶液体积，V/V指溶质体积/溶液体积；

吸除脱脂奶粉后，沿培养皿的侧壁加入2mL的PBST（即含0.02%Tween-20的PBS）清洗4次，每次5min；

向500μL封闭液中加入2μL的anti pan cytokeratin和3μL的CD45，anti pan cytokeratin即抗广谱细胞角蛋白，CD45即白细胞共同抗原，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜；

吸除抗体，用PBST清洗三次，加入1mL的DAPI，DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，常温避光孵育30min；

e. 扫描：

吸除抗体，用2mL的PBST清洗三次，加入1mL的PBS扫描。

2.如权利要求1所述的血液中循环肿瘤细胞的检测方法，其特征是：还包括f步骤鉴定循环肿瘤细胞：

在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色，显蓝色的则DAPI+，不显蓝色则DAPI-，显绿色则CK+，不显绿色则CK-，显红色则CD45+，不显红色则CD45-，根据荧光显色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足最长径不低于12μm的圆润形态特征的为循环肿瘤细胞，然后对所有的循环肿瘤细胞计数，获得检验结果。

3.如权利要求1或2所述的血液中循环肿瘤细胞的检测方法，其特征是：步骤b细胞全富集时，APTES处理培养皿的步骤如下：

i. 将培养皿置于等离子清洗仪中清洗12min，使培养皿表面粘性增加，以便与APTES结合；

ii. 用质量百分比浓度为2%的APTES润洗培养皿表面，避光1小时，使APTES与培养皿中的硅原子充分结合；

iii. 吸除多余的APTES，用纯水清洗培养皿5～6次；

iv. 将培养皿置于80℃烘箱烘干1小时，使APTES充分固定于培养皿表面，处理完毕。