[发明专利]血液中循环肿瘤细胞的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤细胞领域，具体为一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法。

背景技术

原发肿瘤生长到一定阶段会侵扰周围血管，首先通过整联蛋白附着于血管基底膜处生长，随着肿瘤细胞逐渐增多，其分泌的基底金属蛋白酶也逐渐增加，通过逐步消化掉IV型胶原蛋白，突破基底膜屏障进入血液，即被称为循环肿瘤细胞（即CTC），CTC进入血液后会随着血液循环游走全身，形成复发转移。CTC是一种新型肿瘤标志物，通过检测CTC数量可对肿瘤进行确诊、判断预后和监控疗效，通过对比手术和放化疗前后血液中的CTC数量，可以判断治疗是否有效。

目前CTC富集的方法主要有两类。第一类是基于抗体分离CTCs（CTCs是CTC的复数形式）。最常见的是正性分离，即用抗体与CTCs表面受体结合来分离。这类技术通常以EpCAM抗体标记的磁珠与表达EpCAM的CTCs结合来分离CTCs。正性分离的缺陷在于：很多肿瘤细胞不表达或弱表达EpCAM。如：超过一半的ALK基因融合阳性的肺癌CTCs弱表达甚至完全不表达EpCAM，从而导致检测结果假阴性。另一种是负性分离，利用CD45抗体标记的磁珠去除白细胞后，收集剩余细胞做CTCs检测。负性分离的效率在50~80%间大幅波动。主要原因在于CTCs会吞噬磁珠，亦或因CTCs与白细胞粘连而被去除，导致分离效率不稳定，甚至在同一病人一个时间点收集的两份血样中，检测到的CTCs数目能出现数量级差异。而最近俄亥俄州立大学肿瘤中心确认了在患者体内，有些癌细胞同时表达CD45和CK。因此利用负性分离也有严重假阴性结果。

总之，利用抗体分离CTCs亟需解决假阴性率高的问题。第二类是基于CTCs物理特性，如大小、密度、表面电荷等，去分离检测CTCs。其中最具代表性的是利用细胞大小来分离。在过滤器件上设计8微米孔阵列，设想CTCs直径普遍都在12 微米以上，且细胞变形性差，故可把CTCs分离出来。但实际分离效果不尽如人意。在临床样本中，直径12μm，甚至8μm的肿瘤细胞经常出现。白细胞尚可通过主动耗能，以阿米巴运动方式，跨越仅几微米宽的血管内皮缝隙，进入到血管周围组织间隙，耗时仅2min～12min。且在过滤过程中，细胞物理性地卡在微孔中，细胞前后两段存在巨大压力差，细胞多有破损。而恶性肿瘤细胞变形性更好，完全可以在几分钟内被动挤过8微米直径的孔隙。因此，传统的利用大小来分离CTCs的技术也有严重的假阴性问题。综上，目前CTCs的检测技术方法都存在缺陷。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，提供一种全富集、高精度的肿瘤细胞富集方法，本发明公开了一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法。

本发明通过如下技术方案达到发明目的：

一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法，其特征是：按如下步骤依次实施：

a. 全血处理：

向2mL全血中加入200μL的红细胞裂解液，室温放置15min，放置期间均匀摇晃；

200RCF（即relative centrifugal force，意为相对离心力，数值表明离心加速度除以重力加速度后所得的倍数）下离心5min，吸除上清液（上清液指在做血液分层试验中位于沉积固体上层的透明液体，成分为血浆，又称清液层），保留细胞；

向离心管中加入2mL、质量百分比浓度为1%的FPBS溶液，FPBS即血纤蛋白原结合蛋白，混匀后于200RCF下离心5min，去除上清液；FPBS溶液的体积配比为：FBS:PBS=1:99，FBS全称fetal bovine serum，即胎牛血清，PBS全称Phosphate Buffered Saline，即磷酸盐缓冲液；

b. 细胞全富集：

加入1mL的FPBS溶液，混合均匀后转入用APTES处理的培养皿中，APTES即3-氨丙基三乙氧基硅烷，分子式H₂NCH₂CH₂CH₂Si(OC₂H₅)₃，将培养皿置于37℃摇床中培养45min；

培养后将培养皿置于4℃环境中静置10min；

c. 细胞固定：

吸除FPBS，向培养皿中加入质量百分比浓度为4%甲醛溶液后置于4℃环境中静置10min；

吸除甲醛，加入1mL甲醇，置于-20℃环境中静置10min；

吸除甲醇，用2mL的PBS清洗三次；每次加入PBS时沿培养皿的侧壁加入，避免将细胞冲起；

d. 封闭及抗体孵育：