[发明专利]基于近红外荧光探针铜纳米簇的叶酸检测方法

说明书

本发明公开基于近红外荧光探针铜纳米簇的叶酸检测方法，通过绿色合成方法合成卵清蛋白包覆的近红外荧光铜纳米簇，铜纳米簇作为荧光探针，叶酸作为荧光猝灭剂，由于铜纳米簇与叶酸间的静态猝灭作用，叶酸呈线性猝灭荧光探针铜纳米簇荧光强度。本发明检测叶酸的线性范围为0.5‑200μM，检出限为0.2μM。使用的探针铜纳米簇具有无毒、价格低廉、性能稳定、生物相容性等优点，检测方法成本低廉、操作简单、灵敏度高，具有巨大的潜在应用价值。

技术领域

本发明属于生物分析检测技术领域，涉及一种近红外荧光探针铜纳米簇的绿色合成方法对其及对生物小分子叶酸的检测应用。

背景技术

叶酸，作为维生素B族的一种，是生命体内重要的底物和辅酶。缺少叶酸会诱发贫血、白血球减少症、心智发展不足、精神病等等。然而，强化途径摄入过量的叶酸会引起维生素B-12缺乏，进而增加老年人患神经性疾病的概率。所以，发展专一性好，灵敏度高，操作简单的定量检测方法具有重要的意义。目前叶酸的定量检测方法主要有电化学法、高效液相色谱、流动注射化学发光法、分光光度计法和荧光方法。这些方法当中，以叶酸的电化学检测容易收到维生素C的干扰，这是因为维生素C的氧化还原点位与叶酸的比较相近，氧化的维生素C容易附着在电极上影响叶酸的测定。此外，在大多数视频当中维生素C的含量旺旺有远大于也算的含量，这更干扰对叶酸的检测。所以，开发更加简单、具有高选择性和灵敏度的叶酸探针十分重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供基于近红外荧光探针铜纳米簇的叶酸检测方法，水溶的、无毒性的、荧光寿命长的、易储存的、近红外的荧光铜纳米簇合成方法且在室温下利用荧光强度变化对溶液中糖蛋白的操作简单、反应快速、成本低廉、高灵敏度和高选择性的检测方法。

本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：

基于近红外荧光探针铜纳米簇的叶酸检测方法，以磷酸缓冲水溶液(PBS)、铜纳米簇分散体系和待测样品组成叶酸检测体系，检测加入待测样品前后的荧光强度变化，对比标准曲线，得到待测样品中叶酸的含量，线性方程为F₀/F＝1.0589+0.0098C，F₀为不加入叶酸时的荧光强度检测值，F为加入叶酸后的荧光强度检测值，C为叶酸浓度。

上述检测方法中，检出限为0.20μM，检测范围为0.50-200μM。

上述检测方法中，磷酸缓冲水溶液(PBS)浓度为0.01mol/L，25℃，pH＝7.4。

上述检测方法中，磷酸缓冲水溶液3.1mL、铜纳米簇分散体系0.8mL和待测样品100μL组成叶酸检测体系4.0mL。

铜纳米簇分散体系，以卵清蛋白为保护剂，水合肼为还原剂的铜纳米簇，按照下述步骤进行制备

步骤1，称取60-160mg卵清蛋白溶解于装有3-8mL高纯水的烧杯中；

步骤2，向步骤1得到的溶液中加入0.02-0.18mL的0.1M氯化铜溶液，室温条件下搅拌8-12min；

步骤3，向步骤2得到的溶液中加入0.1-1.5mL水合肼水溶液，其中水合肼的质量百分数为80％后，向其中加入高纯水至8-20mL,并在室温条件下搅拌2-5h后，即得到铜纳米簇分散体系。

在制备后，使用截留分子量为6000-8000，直径为25mm透析袋对步骤3制得铜纳米簇进行纯化，每3-5h换一次高纯水，透析20-30h，待透析完成后将纯化的铜纳米簇在真空条件下30-40℃干燥后，得到在340nm光的激发下，发射在625nm近红外荧光探针铜纳米簇。

在步骤3中，水合肼的滴加速度为0.05-0.1mL/min，高纯水的加入速度为0.5-1mL/s。

纯化条件为每4h换一次高纯水，透析24h，待透析完成后将纯化的铜纳米簇在真空条件下35℃干燥。