[发明专利]便捷的刺激NK细胞增殖和分化的饲养层制备方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫细胞细胞实验领域，主要适用于自体NK细胞的分化和扩增，也可用于其他自体免疫细胞的制备，尤其是一种便捷的刺激NK细胞增殖和分化的饲养层制备方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性。NK细胞胞浆丰富，含有较大的嗜天青颗粒，颗粒的含量与NK细胞的杀伤活性呈正相关。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素，也参与第Ⅱ型超敏反应和移植物抗宿主反应。

目前NK细胞的免疫治疗主要是利用细胞因子体内扩增、激活NK细胞和体外产生LAK、CIK细胞杀伤自体肿瘤细胞。从早期的大剂量IL-2治疗的严重毒副作用到随后的长期小剂量联合间断中剂量IL-2治疗证实在HIV感染及恶性肿瘤患者中可以较好耐受。但这种治疗方法只是增强骨髓祖细胞向NK细胞分化及依赖IL-2延迟NK细胞的凋亡,而并非外周血成熟NK细胞的增生[14,15]。因此联合应用IL-2和其他细胞因子(如IL-12,IL-15,KL,FL)可能达到更好的体内和体外扩增NK细胞的效果。

巨噬细胞通常以常在性巨噬细胞存在于机体各组织中，受到刺激后成为活化巨噬细胞，从而获得多种生物学功能，包括对肿瘤细胞的细胞毒功能。与CTL及NK细胞相比，巨噬细胞抗肿瘤作用机理的研究还远不够深入。主要组织相容性复合体是一组高度多态性的基因群，其编码的I及II类分子在抗肿瘤细胞毒作用中起着限制性识别和介导杀伤的重要作用，细胞毒效应细胞的MHC限制性成为肿瘤细胞过继治疗的不利因素。活化巨噬细胞与肿瘤细胞的直接接触是其发挥细胞毒作用的前提条件，细胞粘附分子在此过程中介导效靶细胞间识别、粘附和信号传递，从而参与细胞毒细胞的杀伤机理。因此研究巨噬细胞细胞毒功能的MHC限制性和相关粘附分子在巨噬细胞杀伤时所起的作用，对明确巨噬细胞的杀伤机理是极其重要的。同时巨噬细胞是和树突细胞(DC细胞)类似，都是人体内功能强大的抗原呈递APC细胞。正常的巨噬细胞能够裂解肿瘤细胞、呈递肿瘤相关抗原给T细胞、刺激T细胞和NK细胞的抗肿瘤功能。

饲养层细胞就是指一些特定细胞(如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等已在体外培养的细胞)，经有丝分裂阻断剂(常用丝裂霉素)处理后所得的细胞单层。一般铺在明胶层上(也可不铺)。饲养层细胞大部分可用MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)。不论ES细胞或EG细胞，原代或初期培养阶段一般都需依赖于能分泌他们在体外存活增殖所必需的生长因子的饲养层细胞。不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略有不同，但都要求培养过程中的饲养层细胞不分裂不增殖而仍保持代谢活性。是细胞培养，尤其是胚胎干细胞培养常用的生长增殖促进剂和分化抑制剂。

现阶段NK细胞培养的细胞层主要是以K562细胞系转染改进的饲养层细胞，虽然此技术能大量刺激NK细胞增殖和成熟，虽然经过辐射等处理，但是其癌细胞的本质还是会有风险。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种便捷的刺激NK细胞增殖和分化的饲养层制备方法，本方法是以单核细胞诱导的巨噬细胞为基质，构建的自体细胞的饲养层，方法简单易行，且对于NK细胞以及其他免疫细胞(cik细胞等)具有明显的刺激增殖以及成熟的效果。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种便捷的刺激NK细胞增殖和分化的饲养层制备方法，步骤如下：

⑴采集50mL外周血；

⑵采用ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞；

⑶使用贴壁法分离淋巴和单核细胞，贴壁1个小时；

⑷淋巴细胞添加因子培养NK细胞；

⑸单核细胞添加因子，过夜培养；GM-CSF1000U/mL和IL-4400U/mL；

⑹第二天将单核细胞瓶中悬浮及半贴壁的的iDC重悬，移至新瓶中添加自体血浆培养，用于DC疫苗的制备，原瓶中继续补充因子，补充因子为GM-CSF和IL-4，不添加血浆，进行饥饿培养；

⑺隔天补充因子，补充因子为GM-CSF1000U/mL和IL-4400U/mL，至第五天，巨噬细胞铺满瓶底，此时去除上清，将培养中的NK细胞移入该瓶中进行共培养；