[发明专利]高效扩增人外周血NK细胞的实验方法

权利要求书

1.一种高效扩增人外周血NK细胞的实验方法，其特征在于：步骤如下：

⑴将外周血离心800g，10min，离心采用8升4降的方式，取上清56℃灭活30min，离心2000g，10min，离心采用8升8降的方式，取上清作为自体血清；

⑵用生理盐水倍比稀释血液，将重悬后液体缓慢加注于装有ficoll分离液的离心管中，Ficoll与液体比例＝3：4体积比，离心600g，40min，离心采用1升0降的方式；

⑶吸取白膜层，用生理盐水冲洗，离心400g，10min，离心采用8升4降的方式，重复两次，生理盐水重悬计数，取一定量细胞做流式检测分析细胞初始分选后CD3-/CD56+细胞所占比率，

⑷用培养基KBM501调节细胞浓度，以细胞终浓度为2×10⁶个/mL接种在细胞中加入额外添加细胞因子IL-15为10-50U/mL，CD3为0.5-500ng/mL，CD16为50-100ng/mL和5％自体血清，置于空气CO₂含量为5％的二氧化碳培养箱中，37℃培养，

⑸培养至D3-D5天，混匀计数，水平离心，转速300g，时间5min(9升9降)，离心后去上清，用不含细胞因子的KBM501培养基调节细胞浓度，培养基含5％自体血清，以细胞终浓度为1.5×10⁶个/mL接种，置于CO₂含量为5％的二氧化碳培养箱中，37℃培养，

⑹培养至D7天，将D3-D5去除细胞因子后培养的NK细胞吹悬混匀计数，取2×10⁶个细胞用于流式检测NK表型(CD3-/CD56+)，将剩余细胞转移至50ml离心管中，水平离心，转速300g，时间5min，离心采用9升9降的方式，去除原有培养液，更换新鲜培养基，培养基组成为：KBM501：KBM502＝1:1，含1％自体血清，调节细胞浓度，以细胞终浓度为1.5×10⁶个/mL接种，置于CO₂含量为5％的二氧化碳培养箱中，37℃培养，

⑺培养至细胞数目满足要求水平离心，转速300g，时间5min，离心采用9升9降的方式，离心后去上清，用15ml生理盐水重悬细胞，水平离心，转速300g，时间5min，离心采用9升9降的方式，离心后去上清，重复4次，用40ml生理盐水重悬细胞，80目细胞筛过滤细胞至50ml离心管中，计数，水平离心，转速300g，时间5min，离心采用9升9降的方式，离心后去上清，用20ml注射器从100ml生理盐水瓶中抽取20ml生理盐水重悬细胞，用20ml注射器将细胞悬液转移至原瓶中，

培养14天的时间，细胞总数扩增100-500倍，其中NK细胞数目扩增1000-3000倍。