[发明专利]高效扩增人外周血NK细胞的实验方法

说明书

技术领域

本发明用于生物技术领域，主要用于细胞培养和免疫疗法，涉及一种利用自体外周血中单个核细胞体外培养高纯度高扩增倍率NK细胞的方法。

背景技术

NK细胞(natural killer cel1)发现距今已有35年的历史，属于固有免疫系统，是人体免疫系统的第一道防线。NK细胞在杀伤靶细胞的过程中无MHC限制性，可有效杀伤多种肿瘤细胞。目前，NK细胞的过继治疗在抗病毒、抗肿瘤的治疗中取得了一定的临床疗效，但是正常人体外周血中NK细胞数量较少，仅占外周血淋巴细胞的10％～15％，同时也存在于外周组织中，如肝脏、腹膜腔、胎盘等。建立一种有效的NK细胞体外扩增系统是深入研究NK细胞功能与探讨NK细胞免疫治疗的基础，因此，如何获得高质量、高纯度的NK细胞成为现今NK细胞临床应用最为关键的问题之一。体外扩增人NK细胞主要有两种途径：一是采用工程细胞K562作为饲养层细的方法；二是采用刺激扩增培养的方法，从PBMC中扩增培养人NK细胞。前者可以快速获得NK细胞，但只适用于研究分析，由于K562细胞本身为肿瘤细胞，在临床应用上存在一定的风险。后者则是以PBMC为原始材料，通过特定细胞因子的刺激，使NK细胞在体外得到特异的扩增，这种方法是目前被认为比较有应用前景的方法，通过体外的刺激培养可进行相对大规模的NK细胞制备，使临床应用成为可能。研究者在探讨不同细胞因子组合对NK细胞体外扩增效果的同时，也对培养基的选择进行了研究，并取得了令人满意的疗效。虽然NK细胞体外扩增方案很多，但对于前期NK细胞纯化比较尚未报道。为比较不同培养方案对NK细胞的体外扩增效率，本发明针对人外周血中细胞成分不同对NK细胞高效扩增的影响。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高效扩增人外周血NK细胞的实验方法，本发明使用相应的技术手段去除杂细胞，运用因子复配并在合适时间内去除因子，解决了传统因子刺激后得到的NK细胞表型不高、细胞数目扩增倍数少的问题，通过短时间的培养可以得到淋巴群高，活率高，数量高的NK细胞。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种高效扩增人外周血NK细胞的实验方法，步骤如下：

⑴将外周血离心800g，10min，离心采用8升4降的方式，取上清56℃灭活30min，离心2000g，10min，离心采用8升8降的方式，取上清作为自体血清；

⑵用生理盐水倍比稀释血液，将重悬后液体缓慢加注于装有ficoll分离液的离心管中，Ficoll与液体比例＝3：4体积比，离心600g，40min，离心采用1升0降的方式；

⑶吸取白膜层，用生理盐水冲洗，离心400g，10min，离心采用8升4降的方式，重复两次，生理盐水重悬计数，取一定量细胞做流式检测分析细胞初始分选后CD3-/CD56+细胞所占比率，

⑷用培养基KBM501调节细胞浓度，以细胞终浓度为2×10⁶个/mL接种在细胞中加入额外添加细胞因子IL-15为10-50U/mL，CD3为0.5-500ng/mL，CD16为50-100ng/mL和5％自体血清，置于空气CO₂含量为5％的二氧化碳培养箱中，37℃培养，

⑸培养至D3-D5天，混匀计数，水平离心，转速300g，时间5min(9升9降)，离心后去上清，用不含细胞因子的KBM501培养基调节细胞浓度，培养基含5％自体血清，以细胞终浓度为1.5×10⁶个/mL接种，置于CO₂含量为5％的二氧化碳培养箱中，37℃培养，

⑹培养至D7天，将D3-D5去除细胞因子后培养的NK细胞吹悬混匀计数，取2×10⁶个细胞用于流式检测NK表型(CD3-/CD56+)，将剩余细胞转移至50ml离心管中，水平离心，转速300g，时间5min，离心采用9升9降的方式，去除原有培养液，更换新鲜培养基，培养基组成为：KBM501：KBM502＝1:1，含1％自体血清，调节细胞浓度，以细胞终浓度为1.5×10⁶个/mL接种，置于CO₂含量为5％的二氧化碳培养箱中，37℃培养，