[发明专利]脐带间充质干细胞上清液的收集方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞上清液收集方法，其特征在于：方法由下列步骤组成

⑴取足月产健康剖腹产胎儿脐带，取出放置烧杯中用PBS反复冲洗干净，去除残留在脐带上的血液，获得干净脐带；

⑵将脐带的静脉和动脉血管用器械钝性分离出来；

⑶将剩余的沃顿氏胶剪成0.5-1cm左右小段，用镊子放入无菌烧杯中；

⑷将烧杯中的脐带小段剪碎成大小为1mm³以下的组织块；

⑸将组织块转移至无菌培养瓶中，均匀平铺在瓶底，放置于CO₂培养箱中干燥1小时；

⑹向每个培养瓶中加入含血清的DMEM/F12培养基10ml，37℃，5％CO₂静置培养；

⑺6天后换液，以后每5天全量换液一次，待细胞融合度达到80％进行传代；

⑻用PBS冲洗培养瓶，吸弃组织块，每瓶加入胰蛋白酶，消化3-5分钟后，用血清终止消化；

⑼收集终止后的消化液，1000rpm，5min离心，吸弃上清液，收获间充质干细胞；

⑽将间充质干细胞按照8000个/cm²进行接种，约每3天传代一次；

⑾间充质干细胞传至P5代时吸弃原培养基，PBS冲洗瓶底，加入不含酚红的无血清DMEM/F12培养基，同时按照20μg/ml的浓度加入配制好的人参皂苷饥饿培养；

⑿饥饿培养72小时后收集细胞上清液，4000g，20min离心；

⒀收集离心后的上清液，0.22μm滤器过滤，将滤液收集到无菌收集管中，-80℃冷冻，后将冷冻凝固的上清液抽真空，生化干燥，制备出冻干粉，-20℃冷冻保存。

2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞上清液收集方法，其特征在于：所述的步骤⑷中将脐带机械剪碎的工具为剪刀。

3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞上清液收集方法，其特征在于：所述的步骤⑸中无菌培养瓶为75cm²培养瓶。

4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞上清液收集方法，其特征在于：所述的步骤⑹中加入血清与DMEM/F12培养基的比例是1:10。