[发明专利]脐带间充质干细胞上清液的收集方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要应用于临床患者皮肤创面的治疗，尤其是一种脐带间充质干细胞上清液的收集方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells)MSCs是一类来源于早期中胚层，具有高度自我更新和多向分化能力的一类多能干细胞，由于其良好的自我分化、免疫调节和强大的抗炎能力，在临床治疗方面越来越多的受到专家的重视。经研究表明，MSCs具有自分泌和旁分泌功能，能够在局部分泌多种蛋白，引导细胞的迁移、分化，改善局部供血功能、消除局部炎症反应。MSCs分泌的活性蛋白主要涉及促细胞迁移类、受体类、促细胞分化类、调节类和血管生成等几类。这些不同种类的活性蛋白在改善修复靶器官组织功能、抗炎、抗凋亡、免疫调节等方面发挥了重要的作用，是其重要的治疗机制之一。因此，除了上述的临床治疗，MSCs在治疗难愈性创面和皮肤病方面发挥着明显的治疗作用，有非常好的治疗效果。

由于新鲜MSCs制剂在保存液中存活24h后开始出现凋亡，因此制备成品后需要迅速运输至临床为患者使用，否则无法获得治疗效果，这使MSCs在临床的应用受到局限。MSCs主要通过分泌机制来实现对创伤的修复，而MSCs培养液中含有大量的分泌因子，因此用MSCs的上清液可以进行替代MSCs制剂的治疗。为此，寻找一种制备简便，可长时间保存的上清液制备方法成为必要。

现有技术存在的缺陷：目前收集MSCs上清液多采用收集不断传代后的细胞培养上清进行混合。细胞培养上清需要加入血清，细胞才能够贴壁增殖，所以上清液中含有外源性血清。而外源性血清是皮肤致敏的主要致敏原，如果将这种上清液涂抹于皮肤上，尤其是有严重创面的皮肤，失去表皮与真皮的保护，会有一定程度的过敏风险。上清液中的细胞因子全部由细胞分泌，因此细胞的生长状态尤为重要。细胞生长状态佳，分泌细胞因子的含量就会提高，保证细胞最佳的生长状态是重要的一个环节。目前培养细胞多用DMEM/F12培养基，细胞状态完全依赖于原代细胞状态，经过不断的传代，细胞状态也会随之衰减，影响细胞因子的分泌量。细胞因子属于一种蛋白质，在常温状态下很不稳定，光照、氧化、温度都会使其降解，失去促细胞增殖作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种脐带间充质干细胞上清液的制备方法。本方法去除了易致敏的外源性血清，改用无血清培养基饥饿培养收集上清液。本方法加入人参皂苷这种中药提取成分，提高细胞生物活性，增加细胞因子的分泌量，同时人参皂苷自身可促进细胞增殖，有助于难愈性创面的愈合，使得治疗效果倍增。本方法将细胞上清液制备成冻干粉，有助于上清液长期的保存和使用。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种脐带间充质干细胞上清液收集方法，方法由下列步骤组成

⑴取足月产健康剖腹产胎儿脐带，取出放置烧杯中用PBS反复冲洗干净，去除残留在脐带上的血液，获得干净脐带；

⑵将脐带的静脉和动脉血管用器械钝性分离出来；

⑶将剩余的沃顿氏胶剪成0.5-1cm左右小段，用镊子放入无菌烧杯中；

⑷将烧杯中的脐带小段剪碎成大小为1mm³以下的组织块；

⑸将组织块转移至无菌培养瓶中，均匀平铺在瓶底，放置于CO₂培养箱中干燥1小时；

⑹向每个培养瓶中加入含血清的DMEM/F12培养基10ml，37℃，5％CO₂静置培养；

⑺6天后换液，以后每5天全量换液一次，待细胞融合度达到80％进行传代；

⑻用PBS冲洗培养瓶，吸弃组织块，每瓶加入胰蛋白酶，消化3-5分钟后，用血清终止消化；

⑼收集终止后的消化液，1000rpm，5min离心，吸弃上清液，收获间充质干细胞；

⑽将间充质干细胞按照8000个/cm²进行接种，约每3天传代一次；

⑾间充质干细胞传至P5代时吸弃原培养基，PBS冲洗瓶底，加入不含酚红的无血清DMEM/F12培养基，同时按照20μg/ml的浓度加入配制好的人参皂苷饥饿培养；

⑿饥饿培养72小时后收集细胞上清液，4000g，20min离心；

⒀收集离心后的上清液，0.22μm滤器过滤，将滤液收集到无菌收集管中，-80℃冷冻，后将冷冻凝固的上清液抽真空，生化干燥，制备出冻干粉，-20℃冷冻保存。

而且，所述的步骤⑷中将脐带机械剪碎的工具为剪刀。

而且，所述的步骤⑸中无菌培养瓶为75cm²培养瓶。