[发明专利]检测细胞分泌细胞因子的试剂盒、其制备方法及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物类免疫检测试剂领域，特别涉及一种检测细胞分泌细胞因子的试剂盒、其制备方法及检测方法。

背景技术

癌症严重威胁人类健康和生命，基于对免疫细胞、癌细胞的研究深入，引出癌症的免疫治疗。当前，免疫治疗又以自体CIK细胞(或DC细胞)、D-CIK免疫细胞回输疗法为主。CIK细胞释放的大量炎症细胞因子具有抑瘤杀瘤作用：体外培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-12等，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞及干扰病毒复制，它可直接特异性杀伤肿瘤细胞及病毒感染细胞，促进免疫细胞的回升，提高和改善机体免疫功能，达到免疫杀伤、抑制或消除肿瘤，防止肿瘤复发或远处转移，提高生存质量的目的。

免疫细胞分泌细胞因子功能是起到免疫治疗作用的关键，如何评价细胞分泌细胞因子功能或者通过分析细胞分泌功能反应细胞情况，这是研究免疫治疗或者鉴定免疫细胞的关键，基于这样认知，本发明建立一种新的检测细胞分泌细胞因子功能的方法，本发明对整个细胞研究和应用领域均具有重大意义和价值，能够检测细胞分泌细胞因子功能，对于细胞功能的研究和细胞鉴定、检定创出非常可靠的方法。

相比现有的免疫组化、细胞培养上清的酶联检测，流式细胞术通过打孔酶检测胞内细胞因子等检测方法均有先进性，而且现有的办法都有不可弥补的缺陷：免疫组化是固定的死细胞做检测无法检测细胞存活下分泌出胞外的细胞因子的多少，所以无法鉴定细胞分泌的细胞因子；细胞培养上清的酶联检测只能检测一群细胞分泌在培养上清的细胞因子，不能检测那个细胞分泌的，也不知道那个培养时段分泌情况，无法鉴定单个细胞分泌细胞因子的情况；流式细胞术通过打孔酶检测胞内细胞因子也是无法检测细胞分泌在细胞外面的细胞因子。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的问题，本发明的目的提供了检测细胞分泌细胞因子的试剂盒、其制备方法及应用。对于细胞产品可以利用本发明作为一个质量鉴定项(判别该细胞分泌细胞因子功能如何)，对于细胞因子或细胞分泌产物研究和生产可以利用本发明对于投料和培养细胞的选择有依据可循。本发明对于相关的细胞下游行业如单抗研究和生产，基因工程改造的细胞产物研究和生产，都可发挥重大作用。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一种检测细胞分泌细胞因子的试剂盒，所述试剂盒包括双功单抗、标记单抗、抗右旋-藻红蛋白微珠；所述双功单抗通过配置抗待测细胞膜上分子单抗和抗所述待测细胞分泌的细胞因子单抗偶联而成。

根据权利要求1所述的一种检测细胞分泌细胞因子的试剂盒，其特征在于，所述标记单抗根据所述待测细胞因子而配置标记磁珠和流式检测显色荧光基团的单抗。

根据权利要求2所述的一种检测细胞分泌细胞因子的试剂盒，其特征在于，双功单抗：标记单抗：抗右旋-藻红蛋白微珠为100ng:10ng:50ul；

所述双功单抗为冻干粉；所述标记单抗为冻干粉。

一种检测细胞分泌细胞因子的试剂盒的制备方法，该方法包括步骤：

按照双功单抗:标记单抗:抗右旋-藻红蛋白微珠为100ng:10ng:50ul的比例分别取样；

将取样后的双功单抗、标记单抗、抗右旋-藻红蛋白微珠独立地置于包装容器内，即得。

一种检测细胞分泌细胞因子的试剂盒的检测方法，所述的检测方法包括如下步骤：(1)准备待测细胞，所述待测细胞的细胞混悬液浓度为1×10⁷/ml以下；(2)洗涤所述细胞混悬液中的待测细胞；(3)负载双功单抗：将洗涤后的待测细胞置于试管；加4℃缓冲液至10ml，300g,4-8℃离心10分钟，弃去上清液；加4℃培养液悬浮；加双功单抗试剂混匀，置4-8℃的冰上5分钟；(4)细胞因子分泌期：取待测细胞培养液于37℃稀释步骤(3)所述负载双功单抗后的待测细胞；将稀释后的待测细胞置试管于37℃CO₂培养箱中进行孵育，连续震荡或每5分钟摇匀一次；(5)标记单抗负载细胞：将步骤(4)孵育后的试管置于4-8℃冰上；加入4℃缓冲液洗细胞，300g 10分钟4-8℃离心，弃去上清液；再加4℃缓冲液混悬细胞；加标记抗体；混匀，4℃孵育10分钟；加4℃缓冲液洗细胞，300g 10分钟4-8℃离心，弃去上清液；(6)用抗右旋-藻红蛋白微珠标记磁化；(7)磁化分离；(8)流式细胞仪检测、分析待测细胞及待测细胞分泌的细胞因子。