[发明专利]一种免疫细胞冻存液、其制备方法、冻存方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞保存技术领域，特别涉及一种免疫细胞冻存液、其制备方法、冻存方法及应用。

背景技术

近年来肿瘤和病毒的免疫治疗技术已经慢慢的应用到了临床。如肿瘤疫苗和过继免疫疗法，这些方法主要是通过自体的免疫细胞经体外刺激、培养、扩增然后回输来提高患者的免疫力，目前该类细胞主要有树突状细胞(DC)，细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，自然杀伤细胞(NK)，树突状细胞诱导的杀伤细胞(DC-CIK)，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)等。这些经诱导和扩增培养的免疫细胞，它的初始细胞来源都是外周血或脐血的单个核细胞，而且是直接分离培养。

随着年龄的增长，免疫细胞在体内的活性也会随之降低，所以在年轻时期冻存具有较高活性的免疫细胞，对于未来罹患肿瘤相关疾病的治疗可以起到很好的保障，而且从健康养生的角度来看，也可以在患者本人健康时提取从其外周血中提取免疫细胞，并在以后患者本人出现免疫低下或其他症状时，可以将存储的免疫细胞活化、扩增后回输给患者本人，提高患者的免疫力，因此，保存免疫细胞在基础临床和临床研究上具有重要意义。

目前，细胞冷冻技术是保存细胞的主要方法之一，尤其对供体的免疫细胞深低温保存可以维持其活力。目前国内常采用的冻存液基本是DMSO、人供体血清，免疫细胞基础培养基，如CN104026118A公开了一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用，该免疫细胞冻存液按体积百分比由10％二甲基亚砜、10％人供体血浆和80％opTmizer^TM CTS^TM T-Cell Expansion SFM培养基组成，该免疫细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，不会对人体过继免疫治疗产生影响，但该冷冻液的免疫细胞存活率低。也有将DMSO代替的细胞冻存液，如CN105638642A公开公开一种免疫细胞冻存液及其应用，一种免疫细胞冻存液，其特征在于，其包括以下组分：重组人白介素-2、聚乙二醇、1,2-丙二醇，以及基础培养基或注射用氯化钠，该细胞冻存液将聚乙二醇、1,2-丙二醇代替DMSO，有效降低其对细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏后直接应用的安全性，适合用于细胞冻存复苏后直接应用。由于基础临床研究和临床上对免疫细胞的需求量大，因此研究免疫细胞复苏后细胞存活率高、细胞增殖活性好的冻存液及冻存方法具有非常大的意义。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的问题，本发明的目的提供了一种免疫细胞冻存液、冻存方法及应用，能够使免疫细胞复苏后免疫细胞存活率高、免疫细胞增殖性好。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一种免疫细胞冻存液，所述免疫细胞冻存液组分包括：DMSO、丙二醇、海藻糖、甲基纤维素、谷胱甘肽、丙酮酸钠、人供体血浆；其重量比为：5％～15％DMSO、1％～5％丙二醇、2％～8％海藻糖、3％～8％甲基纤维素、0.3％～1.2％谷胱甘肽、0.06％～0.14％丙酮酸钠、60％～80％人供体血浆。

上述的一种免疫细胞冻存液，其中，所述免疫细胞冻存液组分包括：8％～12％DMSO、2％～4％丙二醇、3％～6％海藻糖、4％～7％甲基纤维素、0.5％～1％谷胱甘肽、0.08％～0.12％丙酮酸钠、74％～78％人供体血浆；优选地，10％DMSO、3％丙二醇、5％海藻糖、6％甲基纤维素、0.8％谷胱甘肽、0.1％丙酮酸钠、75.1％人供体血浆。

上述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于，所述甲基纤维素为甲基纤维素1500cp。

一种免疫细胞冻存液的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：(1)制备人供体血浆；(2)按重量比称取各组分，将称取的丙二醇、海藻糖、甲基纤维素、谷胱甘肽、丙酮酸钠和人供体血浆先混合均匀，再立即与DMSO混合，过滤，2-8℃预冷，即得所述免疫细胞冻存液。

上述免疫细胞冻存液的制备方法，其中，步骤(1)所述制备人供体血浆的方法：通过将抗凝外周血离心，吸取上层血浆，水浴，离心弃沉淀，即获得所述人供体血浆。优选地，将所述抗凝外周血低速离心，2000-2500rpm,7min；吸取上层血浆，上层血浆56℃水浴30min；然后15000rpm离心5min弃沉淀，即获得所述人供体血浆。肝素抗凝的血浆低速离心后，在冻融时可能会出现沉淀，进而影响冻存复苏后细胞收集，而本发明在获得人供体血浆中采用15000rpm，5min这一高速离心能有效避免这一问题。