[发明专利]一种人博卡病毒1型抗体间接ELISA诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种诊断试剂盒，具体涉及一种人博卡病毒1型抗体间接ELISA诊断试剂盒。

背景技术

人博卡病毒1型(human bocavirus 1，HBoV1)是在儿童急性呼吸道感染样本进行大规模筛查而发现的一种新的细小病毒。自从人博卡病毒1型被报道发现以后，一些国家和地区相继报道在上、下呼吸道感染患者的呼吸道标本中检测到该病毒，证明了人博卡病毒在全世界范围内存在，该病毒的流行成为一个全球性问题。在我国，先后在浙江省、湖南省、北京市及香港地区、台湾地区等地方检测到了人博卡病毒感染的样本。容易被人博卡病毒感染的人群大多为2岁以下的婴幼儿，引起的相关呼吸道疾病主要有肺炎、支气管炎、鼻炎、咽喉炎，也有少数研究报道感染该病毒后导致结膜炎、皮疹、哮喘等。其主要临床表现为咳嗽、流鼻涕、呼吸困难和发烧。

针对人博卡病毒的感染，临床症状并不能有效诊断病原，其病原的确诊必需进行实验室诊断。目前己报道的关于人博卡病毒检测的研究工作均采用PCR技术和Real-time PCR扩增技术。然而，这些方法存在操作繁琐、价格昂贵等缺点。酶联免疫吸附试验(ELISA)因其操作方便、快速、敏感、特异性强等优点现已被广泛应用于许多病原的抗原或抗体的检测。VP2是人博卡病毒1型主要的抗原基因，也是人博卡病毒血清学诊断研究的热点。然而VP2蛋白制备难度很大，筛选能稳定而大量表达的免疫原性强的抗原基因是建立人博卡病毒感染可靠ELISA诊断方法的关键。目前还没有一种稳定而可靠的人博卡病毒血清学诊断方法，这是当前人博卡病毒防治急需解决的问题，建立快速而有效的人博卡病毒诊断方法，对于人博卡病毒的防治具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供了一种人博卡病毒1型抗体间接ELISA诊断试剂盒，该试剂盒能特异性检测出人博卡病毒1型的抗体，可用于人博卡病毒1型感染后的抗体检测。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种人博卡病毒1型抗体间接ELISA诊断试剂盒，包括包被抗原的ELISA抗体检测板和酶标二抗。所述的抗体检测板上包被的抗原为人博卡病毒1型结构蛋白VP2的N端210个氨基酸的截短蛋白(VP2N)，其包被量优选为1μg/孔。所述的酶标二抗为羊抗人酶标二抗。所述的人博卡病毒1型结构蛋白VP2的N端210个氨基酸的截短蛋白的氨基酸序列及其编码序列分别如SEQ ID NO.1、2所示。

为方便使用，所述的人博卡病毒1型抗体间接ELISA诊断试剂盒还可以包括其它的相关试剂，如洗涤液、显色液、终止液等。

所述的人博卡病毒1型结构蛋白VP2的N端210个氨基酸的截短蛋白优选通过包括如下步骤的方法制备：

(1)以人博卡病毒1型基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增：

上游引物：CGAGCTCTCTGACACTGACATTCAAGA，

下游引物：CCCAAGCTTATTGCCTCCAGCTGCA。

(2)将扩增的PCR产物、表达载体pET28a(+)用Sac I、Hind III酶切后再连接，构建原核表达载体pET28a-VP2N。

(3)用原核表达载体pET28a-VP2N转化大肠杆菌BL21(DE3)，将阳性重组菌进行诱导表达、纯化得到目的蛋白。所述的诱导、表达具体为：将阳性重组菌接种于含卡那霉素的LB培养基中进行IPTG诱导表达；收集表达的宿主菌并超声裂解，用8M尿素溶解包涵体并用滤膜过滤，经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化得到目的蛋白。

本发明试剂盒中所用的包被抗原为人博卡病毒1型结构蛋白VP2的N端210个氨基酸的截短蛋白(VP2N)，VP2N是人博卡病毒1型结构蛋白VP2基因中的一段抗原性和亲水性都很强的靶序列。VP2基因编码人博卡病毒1型衣壳蛋白，目前对于VP2的研究主要集中在新型基因工程疫苗方面。经本发明试验证明，由原核表达系统表达的重组VP2N蛋白所建立的间接ELISA检测方法，能通过抗体检测特异性人博卡病毒1型感染，具有很强的实用性和推广性，有着非常广阔的市场前景。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明所采用的VP2N重组蛋白便于大量制备和纯化，VP2N基因在pET原核表达系统中可得到稳定而高效的表达，携带组氨酸标记的重组蛋白易于纯化。

(2)本发明的诊断试剂盒具有很强的实用性，可用于人博卡病毒感染后的抗体检测或人博卡病毒感染的诊断。