[发明专利]基于PPARγ信号通路的药物筛选模型的构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种基于PPARγ信号通路的药物筛选模型的构建和应用。

背景技术

近年来，随着生活水平的提高，人们的饮食结构和习惯在不断变化，而由此引发的高血压、高血脂、糖尿病、动脉粥样硬化、冠心病、肥胖症和癌症也正困扰着越来越多的人，与此同时随着科学研究的不断深入，也发现上述疾病的相关性十分的密切。PPARs(过氧化物酶体增殖物激活受体，Peroxisome proliferator-activated receptors)，是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员(Zhu，Kan等，2000)。根据结构的不同，PPARs可分为PPARα、β、γ三种亚型(Berger和Moller，2002)。现已发现PPARs可调节基因的表达，在细胞分化、发育、代谢和肿瘤发生上都起着至关重要的调节作用，其中对PPARγ的研究最为深入，其主要表达于脂肪组织及免疫系统，与脂肪细胞分化、机体免疫及胰岛素抵抗关系密切(Michalik等，2006)。PPARγ与许多疾病的发病机理有关，比如糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化和癌症等(Berger和Moller，2002)，PPARγ具有调控脂肪酸储存和葡萄糖代谢的作用，而PPARγ下游基因可以促进细胞脂质的摄取并加速脂肪的生成。PPARγ也可通过抑制影响NF-κB、STATs、激活蛋白-1等信号通路来抑制靶基因启动子激活和转录。PPARγ还可以降低很多心血管细胞，特别是内皮细胞的炎症反应(Hamblin等，2009)。PPARγ还能活化PON1基因，增加肝脏对氧磷酶的合成和释放，进而降低动脉粥样硬化的发生几率(Khateeb等，2010)。PPARγ敲除的小鼠在高脂食物投喂处理时不能生成脂肪组织(Jones等，2005)。

作为一种核内受体转录因子，PPARγ的配基(又称激活剂)可分为两种，包括天然配基和合成配基。天然配基有15-脱氧前列腺素J2及其代谢产物和不饱和脂肪酸等；合成配基有胰岛素增敏剂噻唑烷酮类化合物(TZDs)，是一种高效配基。1995年TZD类化合物被发现，它能高效的与PPARγ结合并活化PPARγ启动下游基因的表达(Lehmann等，1995)，靶向PPARγ降低血糖，且不增加胰岛素分泌以此来治疗糖尿病(Forman等，1995)。其中我们用到的阳性对照罗格列酮就属于此类物质，此外还有吡格列酮和曲格列酮，这三种TZD类药物已被FDA认证，用于治疗II型糖尿病。也有报道指出吲哚美辛等非甾体类抗炎药也能结合并活化PPARγ(Lehmann，Lenhard等，1997)，现如今PPARγ的激动剂已经被应用于治疗高血脂和高血糖(Li等，2008)。而PPARγ的拮抗剂理论上可以抑制脂肪细胞的生成，防止肥胖，但目前临床应用较少。

到目前为止，国内关于PPARγ的激动剂和拮抗剂的高通量药物筛选方法大多局限于蛋白质水平的小分子化合物筛选，例如SPR技术，操作比较繁琐。本发明通过构建一种基于PPARγ信号和荧光素酶报告基因的筛选系统，能够通过荧光强度判断药物的直接作用，从而能够快速确定与PPARγ信号有关的候选化合物，靶向性高，可操作性好，更能作为高通量药物筛选的最佳选择。

发明内容

本发明第一方面提供一种分离的多核苷酸序列，选自：

(1)N1-(AGGTCA-N-AGGTCA)_m-N2；和

(2)(1)所示序列的互补序列；

其中，N1是粘性末端序列或不存在；N2是粘性末端序列或不存在；N为接头序列，长1－25个碱基，由选自A、G、T和C的碱基组成；m为1－50的整数。

在一个具体实施方式中，每个重复单元AGGTCA-N-AGGTCA中的接头序列N可以相同或不同。

在一个具体实施方式中，m为1－25的整数。

在一个具体实施方式中，N为T。

在一个具体实施方式中，所述分离的多核苷酸序列选自SEQ ID NO:2。

本发明第二方面提供一种载体，该载体含有本发明的分离的多核苷酸序列和荧光素酶报告基因。

在一个具体实施方式中，所述载体中，本发明分离的多核苷酸序列位于所述荧光素酶报告基因的上游。

本发明第三方面提供一种慢病毒表达载体，所述载体含有PPARγ表达元件。

本发明第四方面提供一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明所述的含本发明分离的多核苷酸序列的载体。

在一个具体实施方式中，所述试剂盒还含有含PPARγ表达元件的慢病毒表达载体。