[发明专利]一株表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人肠道病毒EV71型重组病毒及其应用

权利要求书

1.一株表达绿色荧光蛋白基因的人肠道病毒EV71型重组病毒的制备，具体步骤如下：

(1)携带EGFP基因的全长感染性克隆的构建

在EV71型病毒基因组的第7218位碱基后插入link序列，EV71型病毒基因组的第1-7218位如SEQ ID NO.1所示，link序列如SEQ ID NO.2所示，link序列之后插入自带终止密码子TTA的EGFP基因，自带终止密码子TTA的EGFP基因序列如SEQ ID NO.3所示，最后连入EV71型病毒3’端非翻译区，即第7218位以后序列，第7218位以后序列如SEQ ID NO.4所示，在连接好的基因组序列的5’端添加Sac I酶切位点，3’端添加Not I酶切位点；

通过PCR的方法获得各个片段，相邻片段间有20bp的相同碱基，将PCR产物与用SacI和Not I线性化的pEGFP-N1载体等比例混合，用EZfusion同源重组酶处理后转化大肠杆菌，即获得重组EV71型病毒基因组；

(2)重组病毒的拯救

用大提试剂盒提取pEGFP-N1-EV71-link-EGFP质粒，将大提的质粒转染至生长为70％的RD细胞培养板中，6孔板，转染剂量为2.5μg，6h后换为含有质量分数为3％胎牛血清的DMEM维持液，并将转染的六孔板置于37℃、5％CO₂孵箱中培养72h，使质粒能够在细胞内更有效的转录病毒基因组RNA；72h后换为2％的DMEM维持液，并将细胞转移到33℃、5％的CO₂孵箱中培养72h；在33℃、5％CO₂培养3天后的细胞，以1:3的比例传代到细胞培养瓶中，37℃、5％CO₂培养48h；待细胞融合达到80％时，换为2％的DMEM维持液，转入33℃、5％CO₂孵箱中进行培养，3天后收取细胞和上清，经37℃与-80℃反复冻融3次，混合后于3000r/min离心5min，0.45μm的滤膜过滤，即得表达绿色荧光蛋白基因的人肠道病毒EV71型重组病毒，命名为EV71-link-EGFP。

2.根据权利要求1制备的表达绿色荧光蛋白基因的人肠道病毒EV71型重组病毒。

3.根据权利要求2所述的表达绿色荧光蛋白基因的人肠道病毒EV71型重组病毒，其特征在于，link序列来自B型肝炎病毒的link序列。

4.根据权利要求2所述的表达绿色荧光蛋白基因的人肠道病毒EV71型重组病毒在高通量筛选抗病毒中药方面的应用。

5.根据权利要求3所述的表达绿色荧光蛋白基因的人肠道病毒EV71型重组病毒在高通量筛选抗病毒中药方面的应用。