[发明专利]一株表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人肠道病毒EV71型重组病毒及其应用

说明书

本发明公开了一株表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人肠道病毒EV71型重组病毒及其应用。本发明在EV71型病毒基因组的3D蛋白编码区后面添加B型肝炎病毒的link序列，而后将EGFP基因连入link与EV71型病毒3’非翻译区之间，从而构成荧光蛋白标记的病毒基因组，该结构不影响病毒翻译后的蛋白加工修饰，产生的EGFP蛋白也不影响子代病毒颗粒组装。转染RD细胞拯救出表达EGFP基因的重组病毒。该病毒能够高效表达EGFP基因，病毒生长曲线与野生病毒株相似，插入的EGFP基因在连续传代过程中较为稳定。该荧光标记病毒株可用于借助酶标仪建立中草药或中草药单体抗病毒的高通量筛选技术(平台)。

技术领域

本发明涉及一株表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人肠道病毒EV71型重组病毒及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

肠道病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，分为肠道病毒A(humanenterovirus A,HEV-A)、B(HEV-B)、C(HEV-C)、D(HEV-D)等4种类型。肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)属于HEV-A。EV71自1969年首次被报道以来，已经引发全球范围内的10多次爆发与流行。EV71感染主要引起患者手足口病，还能引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种与神经系统相关的疾病。

EV71的基因组为约7.4kb的单股正链RNA，仅含一个开放阅读框(open readingframe,ORF)，编码含有2193个氨基酸的多聚蛋白(poly-protein)。在基因组的5'端和3'端分别有约为745nt的5'非编码区(untranslated region,UTR) 和约为83nt的3'非编码区。

目前，人类是该病毒唯一已知的自然宿主，主要通过粪口传播，还可通过飞沫传播，且10岁以下儿童为主要易感人群，其他则以隐性感染为主。根据VP1的序列差异，主要将EV71分为A、B、C 3个基因型。B和C型各包括5个亚型，分别为B1-B5和C1-C5。目前，尚无有效的疫苗能够预防EV71的感染，临床上也缺乏特异高效的抗病毒药物，只能以对症支持治疗为主。

病毒的结构蛋白或者其他蛋白经荧光蛋白标记后，组装成的重组病毒将带上荧光标记或者在侵染细胞中释放荧光标记，从而能够被示踪。这种荧光标记技术让我们可以在活细胞中显示并研究病毒，近年来，GFP己经成功地用于标记艾滋病病毒、腺相关病毒以及疱疹病毒等多种病毒。

同样国内的研究也日益增多，华中科技大学同济医学院成功地将TC标签 (C-C-P-G-C-C)在基因水平上插入到乙型肝炎病毒HBV核心蛋白免疫主区 c/el位点，获得了动态观察HBV荧光体在活细胞中生物学行为的基因重组乙型肝炎示踪病毒。江军等人则制备了家蚕浓核病毒结构蛋白VP4与EGFP融合表达的荧光病毒样颗粒，为家蚕病毒的防治奠定了基础。山东大学彭莹等构建了表达绿色荧光蛋白的巨细胞病毒Towne株，并检测了其功效，该荧光病毒可以作为研究巨细胞病毒致病机制和抗病毒药物筛选的新型工具。

可见利用各种荧光蛋白或者其他物质对病毒结构蛋白进行标记或者伴随病毒结构蛋白同时表达，即可完成对病毒侵染细胞过程和繁殖状况的观察，也可为抗病毒药物筛选和作用机制研究提供帮助。

朱守海等将EGFP基因连入EV71病毒基因组5’端，实现了EGFP与病毒蛋白的融合表达，最后再利用2A酶活性去除GFP，使EV71病毒子代颗粒顺利组装。然而该设计中添加的EGFP基因在表达成GFP蛋白后，与病毒蛋白呈融合状态，可能会影响病毒蛋白的成熟及组装效率，进而影响病毒的繁殖。发明内容

本发明的目的在于一株表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人肠道病毒 EV71型重组病毒及其应用，本发明利用反向遗传学技术拯救出表达绿色荧光蛋白EGFP基因人肠道EV71型重组病毒，该病毒经传代检验证实具有遗传稳定性，并具有与野生病毒株相当的病毒毒力。