[发明专利]cfDNA建库方法及试剂盒

权利要求书

1.cfDNA建库方法，包括下述步骤：

(1)末端修复后纯化；

(2)在已修复的cfDNA片段的3'端加上一个“A”碱基，并纯化；

(3)用DNA连接酶将随机接头连接至已加A的cfDNA片段的两端，并纯化；

(4)再次纯化加接头的cfDNA片段；

(5)通过PCR扩增文库并纯化产物；

其中，步骤(3)中所述的随机接头是由如下所示的序列退火形成的多条不同双链序列的混合物：

F:5’---AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCTCTT CCG ATC T(N)xGT CAG TAC T--- 3’ (SEQ ID NO:1)

R:5’---GTA CTG CA(N)xA GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT CAC ATCACG ATC TCG TAT GCC GTC TTC TGC TTG--- 3’ (SEQ ID NO:2)

其中，N为随机碱基，每一个N独立地可以是A、G、C、T中的任一个；N的数量，即x为选自3-20中的一个数；且每一条序列中C+G含量保持在40-50%。

2.根据权利要求1的建库方法，其中x为6或8。

3.根据权利要求1的建库方法，其中步骤(3)中所使用的随机接头的制备方法是：将合成好的多条序列分别稀释至10 μM的浓度；然后分别取20 μl混合均匀，转移至PCR管中；将混合好的溶液置于PCR仪中，设置温度为95 ℃，孵育5 min；孵育完成后，直接关闭PCR仪，继续孵育2 小时；获得制备好的随机接头。

4.根据权利要求1-3任一项的建库方法，其中步骤(3)中随机接头与cfDNA的比例为5-300:1。

5.权利要求4的建库方法，其中步骤(3)中随机接头与cfDNA的比例为10-100:1。

6.权利要求5的建库方法，其中步骤(3)中随机接头与cfDNA的比例为50-100:1。

7.随机接头在cfDNA建库中的应用，其中所述随机接头是由如下所示的序列退火形成的多条不同双链序列的混合物：

F:5’---AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCTCTT CCG ATC T(N)xGT CAG TAC T--- 3’ (SEQ ID NO:1)

R:5’---GTA CTG CA(N)xA GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT CAC ATCACG ATC TCG TAT GCC GTC TTC TGC TTG--- 3’ (SEQ ID NO:2)

其中，N为随机碱基（即随机核苷酸），每一个N独立地可以是A、G、C、T中的任一个；N的数量，即x为选自3-20中的一个数；且每一条序列中C+G含量保持在40-50%。

8.根据权利要求7的应用，其中x为6或8。