[发明专利]cfDNA建库方法及试剂盒

说明书

本发明涉及用于cfDNA建库的随机接头、cfDNA建库方法及试剂盒。使用本发明的随机接头进行cfDNA建库，可以提高文库得率。

发明领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及cfDNA建库方法及试剂盒。

背景技术

Illumina测序设备是现在新一代高通量测序(NGS)的常用设备之一，配套使用的是KAPA文库构建试剂盒。附带的DNA文库构建说明书提到的文库构建方法简述如下：(1)末端修复后纯化；(2)加A并纯化；(3)接头连接并纯化；(4)再次纯化；(5)文库扩增并纯化产物。

KAPA试剂盒配套的接头序列如下(F为正向序列，R为反向序列)：

F:5’---AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GACT---3’；

R:5’---ACA CGT CTG AAC TCC AGT CAC ATC ACG ATC TCG TAT GCC GTC TTCTGC TTG---3’。

经修复加A后的cfDNA上的A碱基与接头上的T碱基配对连接，连接成功后的cfDNA就可以通过illumina设备进行测序。

现有的KAPA接头试剂的文库转化效率(建库前后DNA的比例)较低。

发明内容

本发明的目的是提供用于cfDNA建库的接头、cfDNA建库方法及试剂盒。

根据本发明的一个方面，提供用于cfDNA建库的随机接头，所述随机接头是由如下所示的序列退火形成的多条不同双链序列的混合物：

F:5’---AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GACGCT CTT CCG ATC T(N)xGT CAG TAC T---3’(SEQ ID NO:1)

R:5’---GTA CTG CA(N)xA GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT CACATC ACG ATC TCG TAT GCC GTC TTC TGC TTG---3’(SEQ ID NO:2)

其中，N为随机碱基(即随机核苷酸)，每一个N独立地可以是A、G、C、T中的任一个；N的数量，即x为选自3-20中的一个数；且每一条序列中C+G含量保持在40-50％。

由于N是随机碱基，因此当N为不同碱基时可形成不同序列，这些不同序列退火形成的不同双链序列的混合物构成本发明的随机接头。因此，本发明中，所使用的随机接头是混合物，其中含有N为不同碱基时形成的不同序列退火而成的多条不同的双链序列。

在本发明中的随机接头混合物中，不同序列中的N的数量都是相同的，但N的碱基种类不同。例如，优选地，本发明的随机接头可以是由上述序列退火形成的多条不同双链序列的混合物，其中x为6。本发明的随机接头还可以是由上述序列退火形成的多条不同双链序列的混合物，其中x为8。

根据本发明的另一方面，提供上述随机接头的制备方法，包括：将合成好的两条序列分别稀释至10μM的浓度；然后分别取20μl混合均匀，转移至PCR管中；将混合好的溶液置于PCR仪中，设置温度为95℃，孵育5min；孵育完成后，直接关闭PCR仪，继续孵育2小时；获得制备好的随机接头。

根据本发明的另一方面，提供上述随机接头在cfDNA建库中的应用。

根据本发明的另一个方面，提供cfDNA建库方法，包括下述步骤：

(1)末端修复后纯化；

(2)在已修复的cfDNA片段的3'端加上一个“A”碱基，并纯化；