[发明专利]全程C‑反应蛋白荧光免疫层析用活化荧光乳胶微球

说明书

技术领域

本发明属于荧光免疫层析技术领域，具体涉及一种全程C-反应蛋白荧光免疫层析试纸条用的活化荧光乳胶微球及其制备和应用。

背景技术

荧光免疫层析试纸条（试剂卡）因其快速便捷的特性，广泛用于快检领域。待测物抗体标记荧光乳胶微球，乳胶微球在液相中存在着表面电子斥力和范德华力使得液相中的乳胶颗粒保持均匀分布。但是喷涂于玻璃纤维素膜并烘干后随着溶液被蒸发干，表面张力推动乳胶颗粒间无限靠近导致分子间斥力消失，范德华力增大，最终使得多个乳胶分子团聚成大大小小不同的颗粒。当免疫层析时加入样本复溶乳胶微球时，乳胶微球不再均匀分散导致层析失败。因此本领域多采用荧光免疫层析试剂盒，含试纸条加上样本缓冲液。增加了检测复杂度。或者由于乳胶微球部分凝聚，使得检测灵敏度降低，检测结果出现假阴性。另外，乳胶微球的不稳定，也会使得荧光试纸条的稳定性差，不便于保存以及运输。

C-反应蛋白（CRP)是一种急性相蛋白，且是在历史上首先被认识的急性相蛋白之一。其血清或血浆浓度的增加是由炎性细胞因子如IL-6释放所致，它几乎恒定不变地显示有炎症存在。由于C-反应蛋白通常在细菌感染后增高，而病毒感染时不增高，所以测定人血中CRP含量对于有鉴别细菌和病毒感染重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：荧光免疫层析试纸条的荧光乳胶微球在烘干后，容易团聚，分散不均匀，从而导致层析失败或使得检测灵敏度降低。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种全程C-反应蛋白荧光免疫层析试纸条用的活化荧光乳胶微球及其制备，应用该活化荧光乳胶微球制备的全程C-反应蛋白干式荧光免疫层析试纸条，本试纸条可用于体外定量测定人血清、血浆或全血中全程C-反应蛋白的含量。本发明的试纸条可以解决荧光乳胶微球在喷涂、烘干玻璃纤维素膜时发生团聚的现象，以便制备标记物垫，从而得到干式荧光免疫层析试纸条，无需稀释液配置检测试剂盒。

本发明提供的全程C-反应蛋白荧光免疫层析用活化荧光乳胶微球的制备方法，包括如下步骤：

1）取表面活性剂加入pH为8~10的缓冲溶液中，再加入二甲基甲酰胺、N,N’-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺；

2）取氨基表面的荧光乳胶微球的分散液，以缓冲溶液调pH至8~10后，加入到步骤1）所得的混合物中，搅拌反应，反应完毕后，离心去除上清液，得到活化荧光乳胶微球；

其中，所述表面活性剂为氨基酸型表面活性剂、聚乙二醇脂肪酸酯和硬脂酸盐的混合物，三者的重量比为1~5: 1~2:0.5~3。

优选地，所述氨基酸型表面活性剂为月桂酰谷氨酸盐、N-酰基谷氨酸盐或十二烷基二亚甲基氨基二甲酸盐中的一种或其两种以上的组合；所述硬脂酸盐为硬脂酸的钾、钠、铵盐以及三乙醇铵盐中的一种或其两种以上的组合。

优选地，所述氨基酸型表面活性剂为月桂酰谷氨酸钠；所述硬脂酸盐为硬脂酸钠；所述聚乙二醇脂肪酸酯为聚乙二醇单月桂酸酯。

优选地，所述表面活性剂与所述氨基表面的荧光乳胶微球的质量比为500~2000:1。

优选地，步骤1）和步骤2）中所述的缓冲溶液为碳酸缓冲液；步骤2）中的搅拌反应时间为2~4小时，温度为20~30℃；氨基表面的荧光乳胶微球为氨基聚苯乙烯荧光微球。

本发明还提供上述的制备方法得到的全程C-反应蛋白荧光免疫层析用活化荧光乳胶微球。

本发明还提供上述的全程C-反应蛋白荧光免疫层析用活化荧光乳胶微球的标记物工作液的制备方法：取全程C-反应蛋白荧光免疫层析用活化荧光乳胶微球分散于微球缓冲液中，得到标记物工作液；表面活化的荧光乳胶微球在标记物工作液中所占的比例为0.5~2wt%；

其中，微球缓冲液的制备方法为：将BSA、生物防腐剂、雷米邦A和甜菜碱溶于0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液中。

优选地， BSA（牛血清蛋白）、生物防腐剂、雷米邦A和甜菜碱在所述微球缓冲液中的浓度均为0.1wt%。

本发明还提供全程C-反应蛋白荧光免疫层析试纸条的标记物垫的制备方法，包括如下步骤:

1）活化荧光乳胶微球标记的兔IgG的制备：取上述制备方法得到的标记物工作液，离心，弃上清液后，用标记缓冲液复溶，并且同时加入碳二亚胺和兔IgG，搅拌反应，然后离心，弃上清液，最后用标记稀释液复溶；