[发明专利]一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法

说明书

本发明提供了一种猪圆环病毒II型衣壳蛋白重组表达的马克斯克鲁维酵母工程菌，将猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因克隆到表达载体中，并在马克斯克鲁维酵母中重组表达获得猪圆环病毒II型病毒样颗粒。本发明还提供了一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，通过重组马克斯克鲁维酵母的高密度发酵，获得猪圆环病毒II型病毒样颗粒，经分离纯化制备疫苗。本发明提供的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗，注射免疫一次即可获得高水平血清IgG抗体，具有免疫效果好、安全性高、培养操作简单，产量高、生产成本低以及可大规模放大生产等优点，可应用于减少、预防感染猪圆环病毒PCV2所引起相关性临床症状。

技术领域

本发明涉及一种重组猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法，尤其涉及一种利用马克斯克鲁维酵母高产量、低成本制备猪圆环病毒II病毒样颗粒疫苗的方法、以及一种免疫效果好、安全性高的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是迄今发现最小的动物病毒之一，属于圆环病毒科圆环病毒属，是无囊膜的单股环状负链DNA病毒，20面体对称，直径17-20nm，已知PCV具有两个血清型，即猪圆环I型病毒(PCV1)和猪圆环II型病毒(PCV2)，其中，PCV 1为非致病性病毒，PCV2为致病性的病毒。

PCV对养猪业的危害巨大，在世界范围内广泛流行。猪感染后表现为消瘦，淋巴结肿大，气喘，拉稀，还会引起母猪的繁殖障碍性疾病。PCV还会破环感染猪体的免疫系统，造成免疫抑制，引发疫苗免疫失败。临床上，PCV往往跟猪瘟，高致病性蓝耳病，猪细小病毒等混合感染，在猪群中造成了很高的感染率和死亡率。目前，还没有针对该病的特效药物，疫苗接种仍然是防控PCV疾病的最有效措施。

更为严峻的是，我国养猪业中的PVC2已呈现感染日龄早(产房哺乳仔猪即可感染)的状况。因此PCV2已被认为是世界养猪业的重要病原，能引起猪的免疫抑制，造成二重或者三重感染，发病率和死亡率高，给养猪业带来重大危害、和严重的经济损失。目前，PCV2疫苗已经成为继猪瘟、口蹄疫、蓝耳病和伪狂犬等疫苗后用量最大、用量最多的猪病疫苗品种，市场需求量大。

商品化的疫苗主要有灭活疫苗和亚单位疫苗(类病毒颗粒疫苗)两类，免疫效果都很好，对PCV疾病的防控具有重要意义。其中，亚单位疫苗因其安全性较高，免疫效果确切，成为临床使用的首选疫苗。

PCV病毒基因组大小约为1700bp，包含有11个开放阅读框(open reading frame,ORF)，其中ORF1和ORF2是主要的开放阅读框，分别编码非结构蛋白Rep和结构蛋白Cap。Cap蛋白是病毒主要的衣壳蛋白，含有很多保护性抗原决定簇，是疫苗设计的靶标蛋白。目前市场上销售的PCV-2Cap蛋白类病毒颗粒疫苗有两类：

A)一类是大肠杆菌制备的PCV2类病毒颗粒(原核表达)，PCV-2的ORF2基因(Cap蛋白)插入大肠杆菌原核载体中去，利用大肠杆菌表达PCV-2Cap蛋白，制备亚单位疫苗。大肠杆菌表达系统具有生长速度快、易培养、表达蛋白产量高等特点，但其表达的蛋白大多以无活性的包涵体形式存在，经过蛋白变性复性等一系列操作后，可以得到可溶性蛋白。但是原核表达容易出现不具备活性的包涵体，需要进行蛋白复性来提高疫苗效果，成本高，生产周期长(每批次耗时约2-3个月)、效率低，获得的蛋白免疫原性较差；特别是大肠杆菌表达的蛋白虽然经过纯化，依然有可能残留内毒素，免疫动物会产生副反应。

B)另一类由杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达制PCV2类病毒颗粒疫苗由杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达的类病毒颗粒(真核表达)，用PCV-2的ORF2基因(Cap蛋白)插入到昆虫杆状病毒，用昆虫细胞培养，获得重组的PCV-2Cap蛋白，经纯化、与免疫佐剂混合后获得，在临床上以注射方式免疫，真核表达的工艺要求较高，产品中可能会混有杆状病毒颗粒，产生副反应，存在一定的生物安全风险。

发明内容