[发明专利]一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型的建立方法

说明书

本发明公开了一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型的建立方法，通过以下步骤实现：(1)以高龄雄性小鼠作为供鼠；(2)以高龄雌性小鼠作为受鼠；(3)受鼠接受全身照射预处理后，将获自供鼠的骨髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液注射至受鼠。本发明所建立的C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型累及的病量器官多、典型；该模型组织中缺乏C5aR基因，是验证C5a‑C5aR补体途径与cGVHD疾病的相关性的关键性工具；建模型效率高，重复性好，为进行防治人类cGVHD的研究提供新的实验平台。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种小鼠cGVHD模型的建立方法。

背景技术

异基因造血干细胞移植已成为各类血液肿瘤的重要治疗策略，但移植后的主要并发症——慢性移植物抗宿主病成为制约其疗效的主要原因，不仅严重影响患者的生存质量，也是死亡的主要原因，亟需探索慢性移植物抗宿主病的发病机制和防治策略。C5a是补体系统活化产物中的主要强效介质，介导机体重要炎症反应，在增强机体防御功能的同时也可导致严重的免疫炎症损伤。研究已经发现C5a在急性肺损伤、脓毒血症、脑膜炎、类风湿性关节炎和肾小球肾炎等疾病的发生过程中起着重要作用。最新的研究也发现C5a参与急性移植物抗宿主病的病理损伤：全身照射小鼠后，补体表达上调，促进T细胞活化扩增；体内过表达C3aR和C5aR也将促进T细胞活化扩增，加重aGVHD的病理损伤；并且补体衰变加速因子DAF缺失小鼠的aGVHD的病理损伤更为严重。而目前尚未有研究深入探索C5a-C5aR补体途径在cGVHD疾病过程中的致病机理。为明确C5a-C5aR补体途径介导cGVHD疾病的病理机制，并以该途径分子为靶点开展C5a-C5aR补体途径药物研究、细胞靶向治疗等研究，我们在国内外首次建立C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型。该模型的建立，不仅是相关基础研究的重要基础，还为开展疾病防治药物研发等研究奠定基础，具有重要的实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种C5aR基因敲除小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法。

为了实现以上目的，本发明采用了以下技术方案：

一种C5aR基因敲除小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法，通过以下步骤实现：

(1)以高龄B10.D2(Hc1 H2d H2-T18c)雄性小鼠作为供鼠；

(2)以高龄C5aR-/-(C.129S4(B6)-C5ar1tm1Cge/J)雌性小鼠作为受鼠；

(3)受鼠接受直线加速器全身照射(TBI)预处理后，将获自供鼠的骨髓细胞(BMC)悬液及脾细胞(SpC)悬液注射至受鼠。

优选地，所述供鼠及受鼠均采用16周龄小鼠。

具体地来说，所述步骤(3)中，供鼠BMC悬液的制备如下：以颈椎脱臼法处死供鼠后，放入75％乙醇中浸泡3～5min，无菌剥离股骨和胫骨，用RPMI 1640培养液冲洗骨髓腔，收集含有骨髓的液制成单细胞悬液，过滤后用红细胞裂解液破除红细胞，RPMI 1640洗涤3-4次，计数并用RPMI 1640重悬细胞，调整至4×10^7/0.15mL细胞浓度备用。

具体地来说，所述步骤(3)中，供鼠SpC悬液的制备如下：以颈椎脱臼法处死供鼠后，放入75％乙醇中浸泡3～5min，无菌取出脾脏，去除脾脏周围系膜组织，移入平皿内用RPMI 1640培养液洗涤若干次，碾磨，收集细胞冲洗液制成单细胞悬液，过滤后用红细胞裂解液破除红细胞，用RPMI1640洗涤3-4次，计数并用RPMI 1640重悬细胞，调整至4×10^6/0.15mL细胞浓度备用。

具体地来说，所述步骤(3)中，移植当日受鼠接受直线加速器30x30照射野，680cGy，698跳，源皮距为100cm，单次全身照射预处理，照射后立即补充饮水，休息4～6小时后经尾静脉注射终体积为0.3mL的由0.15mL BMC悬液和0.15mLSpC悬液组成的注射液。