[发明专利]一种体外诱导胰岛内分泌细胞形成岛样结构的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种体外诱导成体干细胞或诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS)通过定向诱导分化技术制备的胰岛内分泌细胞，以及胰岛来源的胰岛内分泌细胞系形成岛样结构的方法。

背景技术

干细胞技术是近年来新兴的高科技生物技术，干细胞具有自我更新和多向分化潜能，因此可从干细胞生产出所需的目标细胞产品。目前，干细胞技术在糖尿病领域的基础研究和应用基础研究较为深入，已经可以从多种种类的干细胞定向分化出胰岛素分泌细胞。将这些细胞移植到糖尿病的动物体内可以明显改善糖代谢紊乱。例如：中华人民共和国国家知识产权局公开的申请人为“北京大学”的发明申请200510064431.5，；申请人为“杰龙公司”的发明申请02824367.6等发明创造的主要内容都是将干细胞诱导分化成胰岛内分泌细胞的方法。

应用转基因技术可以从不同种属成体细胞建立诱导性多能干细胞(iPS)，并且将这些细胞定向分化成为胰岛内分泌细胞。另外，某些胰岛来源的内分泌细胞系如胰岛素瘤细胞也可能成为胰岛移植可选择的细胞材料。

在将这些干细胞或iPS细胞向胰岛内分泌细胞后，将其进一步诱导成一定大小的胰岛样结构是必要的。通常，胰岛移植的部位是肝窦，这是因为1)肝窦能为移植的胰岛提供丰富的血供，有利于移植胰岛的存活；2)存活在此处的胰岛能够快速感受到血糖的变化产生胰岛素释放；3)肝脏是胰岛素作用最大的靶器官，分泌的胰岛素可以作用于肝细胞促进糖原的合成，降低血糖；4)肝脏分泌多种免疫抑制因子，有助于减轻排斥反应。但是，如果将干细胞诱导分化后的单个胰岛细胞直接移植到肝窦，细胞可能随血流迁移到其它组织或器官，不能保证其在肝窦内的稳定存活和功能发挥。天然的胰岛是由4种内分泌细胞(α，β，δ和pp细胞)组成的细胞团，并且4种内分泌细胞将的相互作用对调控胰岛素的分泌功能非常重要。因此，将胰岛内分泌细胞诱导成为胰岛样结构不仅有助于移植细胞定位于肝窦，而且能够进一步完善胰岛内分泌细胞的胰岛素分泌功能，有利于提高细胞移植治疗糖尿病的疗效。

通常应用悬浮培养的方法使胰岛内分泌细胞自发聚集成岛。已有的报道显示使用这种方法诱导胰岛样结构形成的时间从2天到14天不等(Endocr J.2004，51(3)：381-6；Am J Physiol Endocrinol Metab.2005，288(3)：E502-9；Exp Clin Endocrinol Diabetes.1995；103Suppl 2：118-22.)，所形成的胰岛大小和效率不一。从应用的角度考虑，只有快速、高效地将胰岛内分泌细胞诱导成大小均一、功能完善的胰岛样结构，才能保证移植的疗效。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种体外诱导胰岛样结构形成的方法。该方法可以快速，高效诱导胰岛内分泌细胞形成大小均一、功能完善的胰岛样结构。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供了一种体外诱导胰岛样结构形成的方法，该方法包括以下步骤：

将由成体干细胞或诱导性多能干细胞(iPS细胞)通过定向诱导分化所制备的胰岛内分泌细胞，或者胰岛来源的胰岛内分泌细胞系进行悬浮培养诱导诱导胰岛样结构形成，所述悬浮培养条件为37℃，5％CO₂，95％N₂培养4～24h；进一步地，优选为37℃，5％CO₂，95％N₂培养6～12h。

本发明所使用的术语“成体干细胞”是指人和动物成体来源的各种干细胞，例如成体组织干细胞、骨髓间充质细胞、造血干细胞等。“iPS细胞”指按照文献报道的技术方法(Cell，2006，126(4)：663-676)从成体细胞通过转基因技术建立的多潜能干细胞。

进一步地，本发明所述方法在悬浮培养过程中可以使用任何已经公开的适于培养胰岛内分泌细胞的培养基配方，这些细胞培养基可以通过商业化途径购买获得，也可以参照公开出版物上的配制方法自行配制获得。常用的细胞培养基，例如M199培养基、1640培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基等。同时为了使诱导胰岛样结构形成的时间缩短并且与天然胰岛的大小和结构更接近，在悬浮培养使用的培养基中添加了下述物质：20％的胎牛血清、4.5g/L的葡萄糖、1～2mmol/L的Ca²⁺、0.01～2mmol/L三磷酸腺苷。