[发明专利]一种烟草中生物胺的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于烟草中生物胺检测技术领域，具体涉及一种烟草中生物胺的测定方法。

背景技术

生物胺是一类具有生物活性的含氮的低分子量碱性有机化合物的总称，它们是生物体自身合成荷尔蒙、核苷酸、蛋白质的前体，可以看作是氨分子中1-3个氢原子被烷基或芳基取代后形成的低分子量生物碱。生物胺根据其结构可以分为三类：脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等)，芳香胺(酪胺、β-苯乙胺等)和杂环胺(组胺、色胺等)。

生物胺主要由氨基酸脱羧作用形成，少部分通过醛或酮的胺化作用形成，各种动植物组织细胞中都含有少量的生物胺，其产生的条件主要有三个：一是有可形成生物胺的游离氨基酸，二是存在可代谢产生氨基酸脱羧酶的微生物，三是适合该微生物生长的环境。生物胺普遍纯在于多种食品和含酒精的发酵饮料中。生物胺不仅是食物香气的重要来源，也是N-亚硝基化合物合成的前体。当人体摄入过量生物胺时，极易引起神经系统和心血管系统损伤，我国于2008年出台了相关标准对食品中的生物胺提出了限量要求。

目前生物胺的检测一般采用高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、薄层色谱法(TLC)和气相色谱法(GC)，上述的检测方法都需要对样品进行衍生，操作较为复杂。目前，高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)由于其不需要对样品进行衍生、且具有高灵敏度和准确性越来越多的应用于痕量高沸点物质的检测。

烟草作为一种特殊的食品，其也含有大量的蛋白质和氨基酸，且其生产过程中需要对原料进行纯化，容易产生生物胺。因此，在烟草生产加工过程中也需要对生物胺进行检测分析。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的缺点，提供一种烟草中生物胺的测定方法，该方法是利用液相色谱-串联质谱法来同时测定烟草中的7种生物胺，能够快速有效的检测烟草中生物胺的含量。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种烟草中生物胺的测定方法，包括以下步骤，

(1)制备混合系列标准工作溶液：配制具有浓度梯度且含有内标的混合系列标准工作溶液；(2)样品萃取：将粉碎后烟草按固液比1g:10～1g:40mL加入到甲酸水溶液-乙腈混合液中，加入100μL500ng/mL内标1,7-庚二胺溶液，混匀后10000～16000转/min离心4min，取出上清液，将滤渣按固液比1g:10mL～1g:40mL加入到甲酸水溶液-乙腈混合液中，混匀后10000～16000转/min离心4min，取出上清液，合并两次得到的上清液，即为样品提取液；

(3)固相萃取柱净化：将步骤(2)得到的样品提取液过混合型阳离子交换固相萃取柱(DIKMA ProElut PXC 150mg/6mL)，洗脱后取洗脱液干燥，溶解于乙腈水溶液中，过0.22μm微孔滤膜得样品净化液；

(4)将步骤(1)得到的含有内标的混合系列标准工作溶液和步骤(3)得到的样品净化液在相同条件下进行HPLC-MS/MS测定；

(5)结果计算：由目标分析物峰面积和内标峰面积之比采用内标法进行定量。

所述步骤(1)制备混合系列标准工作溶液的具体过程如下：配制浓度梯度为0.5，1，2，5，10，25ng/mL的混合标准工作溶液，每个浓度的混合标准工作溶液的内标1,7-庚二胺的浓度为10ng/mL；浓度梯度为0.5，1，2，5，10，25ng/mL的混合标准工作溶液中，腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺、色胺七种生物胺的浓度分别均为0.5，1，2，5，10，25ng/mL(比如混合标准工作溶液梯度为0.5ng/mL时，混合标准工作溶液中腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺、色胺七种生物胺的浓度分别均为0.5ng/mL)。

HPLC-MS/MS测定的条件如下：

色谱条件：

选用亲水作用色谱柱，流速为0.2～0.5mL/min，进样量为5～10μL；分析时间为14min；柱温为40℃；流动相为A和B的混合体系，A为甲酸铵和甲酸的混合水溶液，其中甲酸与水的体积比为0.1:100，甲酸铵的含量15～25mmol/L；B为甲酸乙腈溶液，其中甲酸与乙腈的体积比为0.1:100；采用梯度洗脱，其中B在不同时间段的的体积百分比为：0～1min，95％；1～12min，95％～45％；12～14min，95％；

质谱条件：