[发明专利]一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。该基因工程菌是将含有优化的基因LS和基因NDPS1的重组载体转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)构建而成，所述优化的基因LS和NDPS1的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1～2所示。在此基础上同时过表达基因HMG1和基因ERG12，能使柠檬烯达到0.67mg/g DCW的极高产量。此外，通过对该基因工程菌两相发酵时添加的丙酮酸和十二烷的浓度进行选择，进一步提高柠檬烯的产量。该基因工程菌能用于大规模商业化生产，前景良好。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。

背景技术

柠檬烯普遍存在于天然植物中，因具有令人愉悦的柑橘香味而在食物香精中得到广泛的应用。在香料工业中，柠檬烯本身可用作配制人造橙花、甜花、柠檬、香柠檬油的原料，亦可作为新鲜的头香香料。由于柠檬烯具备药理活性，其在医药领域也有着广泛的应用。同时柠檬烯也是喷气燃料的一种替代品。另外其还是许多重要芳香物质和药物比如紫苏醇、香芹酮和薄荷醇等的前体。

柠檬烯的生产方法主要有天然提取法和微生物发酵法两种。由于从工业废弃物柑橘皮中提取的柠檬烯难免会有农药残留，不适合作为食品添加剂，因此微生物发酵生产柠檬烯具有明显的优势。特别是随着生物技术的快速发展，利用微生物发酵生产柠檬烯及其衍生物成为目前研究的热点之一。

一般通过外源引入柠檬烯合成酶基因生物发酵法生产柠檬烯，目前亟需高产柠檬烯的基因工程菌。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏高产柠檬烯的基因工程菌的不足，提供一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。

发明人付出创造性劳动后发现，针对引入柠檬烯合成基因后解脂耶氏酵母产生柠檬烯的代谢途径，将两个柠檬烯合成相关基因——即来源于番茄，可将异戊烯基焦磷酸和甲基烯丙基焦磷酸缩合为橙花基二磷酸的基因NDPS1；和来源于藿香，可将橙花基二磷酸异构为柠檬烯的基因LS分别进行优化后，将这两个优化的基因转化解脂耶氏酵母能够使其产柠檬烯。发明人进一步发现，在优化上述两个基因的基础上过表达将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因HMG1，并同时过表达将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因ERG12，能极大幅度地提高柠檬烯的产量(参见图1)。此外，发明人发现特定的十二烷的添加量能够在两相发酵中更好地促进解脂耶氏酵母高产柠檬烯。

本发明提供的技术方案如下：

本发明的技术方案之一为：一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将含有优化的基因LS和优化的基因NDPS1的重组载体转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)构建而成，所述优化的基因LS的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.1所示；所述优化的基因NDPS1的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

本发明中，所述尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)为本领域常规的尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母，即自身难以合成尿嘧啶和亮氨酸的解脂耶氏酵母。较佳地，所述尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母Po1f，其按照Madzak C,Tréton B and Roland SB.Strong hybrid promoters andintegrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression ofheterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.J Mol MicrobiolBiotechnol.2000,2(2):207-216中记载的制备方法制得。