[发明专利]氟尿嘧啶疗效相关基因基因多态性检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术及医学领域，特别是涉及药物紫杉醇疗效相关基因OPRT，MTHFR和DPYD基因多态性检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

虽然5-FU的抗肿瘤疗效已得到广泛肯定，但在5-FU临床应用中，时常出现治疗有效率较低和副作用大的问题。科学研究证明氟尿嘧啶类药物的疗效和副作用存在显著的个体差异：患者本身遗传特征的差异是主要的原因之一。

OPRT的主要作用基因定位于人类染色体3q13，主要存在于肝脏中，是一个关于嘌呤、嘧啶和核苷酸合成的酶。OPRT基因的高表达能增加肿瘤组织对5’Fu化疗的敏感性，OPRT的基因表达和酶活性都与基于5’FU的化疗敏感性密切相关。OPRT存在Gly213Ala基因多态性，携带Ala/Ala(C/C)纯合等位基因型的患者比携带Ala/Gly(G/C)和Gly/Gly(G/G)等位基因患者对5-FU的毒性反应更明显，因此不适合进行氟尿嘧啶药物治疗。

二氢嘧啶脱氢酶(DPD)是5-Fu分解代谢和清除的限速酶，DPD活性降低或缺乏时，5-Fu的系统清除率降低。在此状态下用5-Fu治疗，可引发严重的毒性反应；酶活性越低，毒性反应程度愈高。研究发现其药理学基础是-二氢嘧啶脱氢酶基因(DPYD)遗传缺失的不同。在DPYD多态性位点中，有杂合型，野生型和变异型突变；且毒副作用发生率从高到低依次均为突变型、杂合型和野生型。可取上述位点指导应用5-FU个体化治疗。二氢嘧啶脱氢酶基因单核苷酸多态性检测对预测5-FU化疗的毒副反应有一定的指导意义，从而指导个体化用药。

MTHFR(亚甲基四氢叶酸还原酶)是胞内叶酸代谢的关键酶，MTHFR基因存在功能性SNP，即C677T(突变型患者对5-FU敏感性较高)。

关于基因突变检测方法有很多，各国学者对此都进行了大量研究。己经报道的方法包括直接测序法、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP、Scorpions ARMS、TaqMan PCR、ME-PCR等。这些方法各有优缺点，其中在临床和科研中较为常用的方法为直接测序法以及ARMS(Amplification refractory mutation system,扩增阻滞突变系统)法。

直接测序法检测能力有限，其检测灵敏度约20％左右，而且步骤复杂，整个检测过程涉及PCR-电泳-测序-测序结果的解读等一系列的步骤，费吋费力，但是该方法的优点是能够发现一些新的未知突变。

ARMS方法是将分子信标(探针)与特异性的ARMS引物相结合创造出来的，ARMS引物3’端设计在突变位点，最后一个碱基与突变碱基配对，釆用无3’→5’外切酶活性的TaqDNA聚合酶，特异性的识别引物的3’末端，只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效的扩增。当引物与突变模板结合并延伸出相应的产物后，探针两端的荧光基团和淬灭基团分离而产生荧光。目前，市场上相关试剂盒包括QIAGEN公司和厦门艾德公司，价格昂贵。

因此，本研究釆用ARMS技术与SYBR染料相结合的方法，研发出一种拥有完全自主知识产权并且能够快速、敏感而且简便的检测氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性的试剂盒。通过自己研发设计ARMS引物以及将Scorpions探针换为SYBR染料以使检测成本大大降低，这样更适合中国患者OPRT、MTHFR和DPYD基因多态性的检测。综上所述，该检测试剂盒及检测方法是一种灵敏度高，特异性强，方法简单，结果准确的氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性检测方法。

发明内容：