[发明专利]重组质粒pMDMcherry、其构建方法和红色荧光蛋白基因标记鮰爱德华菌的方法

权利要求书

1.一种重组质粒pMDMcherry，其特征在于，其具有如SEQ ID NO:7所示的碱基序列。

2.权利要求1所述的重组质粒pMDMcherry的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、以质粒PRUAL为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，PCR扩增获得序列号为SEQ ID No:3的启动子片段；

(2)、以质粒pLVX-PAmCherry-C1为模板，SEQ ID No:4和SEQ ID No:5为引物，PCR扩增获得序列号为SEQ ID No:6的红色荧光蛋白Mcherry片段；

(3)、以步骤(1)的启动子片段和步骤(2)的红色荧光蛋白Mcherry片段混合作为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:5为引物，进行PCR扩增；

(4)、将步骤(3)的PCR产物与pMD18-T Vector克隆载体连接，转化后经鉴定，得到序列号为SEQ ID No:7的重组质粒pMDMcherry。

3.根据权利要求2所述的重组质粒pMDMcherry的构建方法，其特征在于，步骤(1)的启动子片段和步骤(2)的红色荧光蛋白Mcherry片段的体积比为1:1。

4.根据权利要求2所述的重组质粒pMDMcherry的构建方法，其特征在于，步骤(1)-步骤(3)中所述PCR扩增的反应体系为：5×buffer20ul、dNTPs 8ul、primersense 2ul、antisense 2ul、templet 1ul、Primerstar 1ul、加H₂O至100ul。

5.根据权利要求2所述的重组质粒pMDMcherry的构建方法，其特征在于，步骤(1)-步骤(3)中所述PCR扩增的反应程序为：95℃2min；95℃30s、50℃30s、72℃30s，共30个循环；72℃10min。

6.根据权利要求2所述的重组质粒pMDMcherry的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述连接反应的反应体系为：10×buffer2ul、templet1 5ul、templet2 5ul、templet3 5ul、T4ligase 0.5ul、加H₂O至20ul。

7.一种红色荧光蛋白基因标记鮰爱德华菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、从患病斑马鱼体内分离出鮰爱德华菌：

(2)、制备鮰爱德华菌感受态；

(3)、将权利要求1所述的重组质粒PMDMcherry转入到制备的鮰爱德华菌感受态中，即得。