[发明专利]重组质粒pMDMcherry、其构建方法和红色荧光蛋白基因标记鮰爱德华菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物监测技术领域，特别涉及一种重组质粒pMDMcherry及其构建方法，以及红色荧光蛋白基因标记鮰爱德华菌的方法。

背景技术

斑马鱼是近十几年来发展起来的一种新兴的模式动物。作为一种脊椎动物，它具有许多小鼠所无法达到的优势：斑马鱼体积小，饲养和维持的费用低；繁殖周期短，产卵量大；更为重要的是，斑马鱼胚胎是体外受精，发育过程可被直接连续观察。斑马鱼作为感染性疾病的感染模型越来越受到病原微生物学家的喜爱。

鮰爱德华氏菌为肠杆菌科爱德华氏菌属的细菌。1979年，Hawke首次发现鮰爱德华氏菌感染斑点叉尾鮰，目前已在澳大利亚、泰国、越南、日本、中国等相继发现鮰爱德华氏菌感染鱼类发病，感染对象包括南方大口鲇、斑点叉尾鮰、黄颡鱼、鳗鲶和罗非鱼等，其发病率和死亡率均较高，严重影响水产养殖业的发展。

目前国内对鮰爱德华菌致病机理研究报道较少，而研究细菌致病机理不可避免地要涉及细菌与宿主之间的关系，使用标记基因是监测细菌在宿主内生长、繁殖及其与宿主相互作用关系的有效手段。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种重组质粒pMDMcherry及其构建方法，以及红色荧光蛋白基因标记鮰爱德华菌的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种重组质粒pMDMcherry，其具有如SEQ ID NO:7所示的碱基序列。

本发明还提供了上述重组质粒pMDMcherry的构建方法，包括以下步骤：

(1)、以质粒PRUAL为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，进行PCR扩增，获得序列号为SEQ ID No:3的启动子片段；

(2)、以质粒pLVX-PAmCherry-C1为模板，SEQ ID No:4和SEQ ID No:5为引物，进行PCR扩增，获得序列号为SEQ ID No:6的红色荧光蛋白Mcherry片段；

(3)、以步骤(1)的启动子片段和步骤(2)的红色荧光蛋白Mcherry片段混合作为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:5为引物，进行PCR扩增；

(4)、将步骤(3)的PCR产物与pMD18-T Vector克隆载体连接，转化后进行测序鉴定，得到序列号为SEQ ID No:7的重组质粒pMDMcherry。

在其中一些实施例中，步骤(1)的启动子片段和步骤(2)的红色荧光蛋白Mcherry片段的体积比为1:1。

在其中一些实施例中，步骤(1)-步骤(3)中所述PCR扩增的反应体系为：5×buffer20ul、dNTPs 8ul、primersense 2ul、antisense 2ul、templet 1ul、Primerstar 1ul、加H₂O至100ul。

在其中一些实施例中，步骤(1)-步骤(3)中所述PCR扩增的反应程序为：95℃2min；95℃30s、50℃30s、72℃30s，共30个循环；72℃10min。

在其中一些实施例中，步骤(4)中所述连接反应的反应体系为：10×buffer2ul、templet15ul、templet25ul、templet35ul、T4ligase 0.5ul、加H₂O至20ul。

本发明还提供了一种红色荧光蛋白基因标记鮰爱德华菌的方法，包括以下步骤：

(1)、从患病斑马鱼体内分离出鮰爱德华菌：

(2)、制备鮰爱德华菌感受态；

(3)、将上述重组质粒PMDMcherry转入到制备的鮰爱德华菌感受态中，即得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、红色荧光蛋白(Mcheey fluorescent protein)能够自身催化形成发色结构并在绿光激发下发出红色荧光。作为报告基因，Mcheey是不需要外源底物或辅助因子，就能在活细胞中表达的发光蛋白，Mcheey作为荧光标记分子既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害，因此可实现在体内实时检测标记菌株的情况，能很好地进行菌体跟踪研究。本发明通过巧妙的引物设计，实现了重组质粒PMDMcherry的制备；