[发明专利]双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌的构建方法与应用

权利要求书

1.一种重组载体，其特征在于，在穿梭质粒PHT01的KpnI和BamHI两个酶切位点之间插入通过重叠PCR技术连接优化了的启动子Psrf基因与优化了的启动子Pcry3Aa基因获得的双启动子Psrf-Pcry3Aa基因，在BamHI和AatII两个酶切位点之间插入由柔性连接肽连接得到的RDPE蛋白基因和海藻糖合成酶基因TreS的融合蛋白基因；

所述的优化了的启动子Psrf基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的优化了的启动子Pcry3Aa基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的RDPE蛋白基因核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述的海藻糖合成酶基因TreS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述重组载体的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（i）以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168菌体的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到启动子基因片段Psrf-1和Psrf-2，通过重叠PCR技术将两个片段连接起来得到优化了的启动子Psrf基因；

所述PCR扩增的引物序列如下：

上游引物Psrf-1-F：

5'-GGTACC ATCGACAAAAATGTCATGAAAGAATCG-3'；

下游引物Psrf-1-R：

5'-AACGAAAAATGGGTGAAAAGTTTCATGCGGGATGCCGAAA-3'；

上游引物Psrf-2-F：

5'-AAACTTTTCACCCATTTTTCGTTGACTAAAACATTTTTTTCATTTATAATGAACGGTAGA -3'；

下游引物Psrf-2-R：

5'-AAAAAAAGCACATTGTCATACCTCCCCTAATCT-3'；

（ii）提取苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）LM79菌体的基因组，以基因组为模板，进行PCR扩增，得到优化了的启动子Pcry3Aa基因；

所述PCR扩增的引物序列如下：

上游引物Pcry3Aa-F：5'-TTAGGGGAGGTATGACAATGTGCTTTTTTT

GTTGACTTTGAAGAATTATTAATGTTAAGCTTA-3'；

下游引物Pcry3Aa-R：5'-CGCGGATCCTTTTCTTCCTCCCTTTCTT-3'；

（iii）将步骤（i）制得的优化了的启动子Psrf基因和步骤（ii）制得的优化了的启动子Pcry3Aa基因通过重叠PCR技术连接，制得Psrf-Pcry3Aa基因；

(iv)将步骤（iii）制得的Psrf-Pcry3Aa基因连接到pTOPO-Blunt vector上，制得pTOPO-Blunt-Psrf-Pcry3Aa质粒载体；然后用限制性内切酶KpnI和BamHI对pTOPO-Blunt-Psrf-Pcry3Aa质粒载体和PHT01质粒进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组质粒Psrf-Pcry3Aa-PHT01；

(v)以瘤胃球菌（Ruminococcus sp.）5_1_39BFAA的基因组为模板，进行PCR扩增，扩增得到RDPE蛋白基因；

所述PCR扩增的引物序列如下：

RDPE-F:5'-CGCGGATCCATGAAATATGGTATTTATTACGCTTATT--3'；

RDPE-R:5'-TGCTGCCACCTCCACCGCTACCGACTTCAAATACATGTTTTA CAAA-3'；

(vi)以恶臭假单胞杆菌（Pseudomonas putida）KT2440的基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶基因TreS；

所述PCR扩增的引物序列如下：

上游引物TreS-F：5’-TTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCAA CCCAGCCCGACC-3’

下游引物TreS-R：5’-CCCAAAGACGTCTCAAACATGCCCGCTGC-3’；

(vii)将步骤（v）制得的RDPE蛋白基因和步骤（vi）制得的TreS基因通过重叠PCR技术连接，制得RDPE-TreS基因；

(viii)将步骤（vii）制得的RDPE-TreS基因连接到pTOPO-Blunt vector上，制得pTOPO-Blunt-RDPE-TreS质粒载体；然后用限制性内切酶BamHI和AatII对pTOPO-Blunt-RDPE-TreS质粒载体和Psrf-Pcry3Aa-PHT01质粒进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组载体。