[发明专利]双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌的构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌的构建方法与应用。一种重组载体，在穿梭质粒PHT01的KpnI和BamHI两个酶切位点之间插入通过重叠PCR技术连接优化了的启动子Psrf基因与优化了的启动子Pcry3Aa基因获得的双启动子Psrf‑Pcry3Aa基因，在BamHI和AatII两个酶切位点之间插入由柔性连接肽连接得到的RDPE蛋白和海藻糖合成酶TreS的融合蛋白基因。本发明还涉及利用该重组载体构建双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌的方法及应用。本发明采用双启动子Psrf‑Pcry3Aa自诱导型表达系统自发诱导合成海藻糖合成酶的效果显著优于其它单自诱导型启动子和诱导型启动子表达的效果。

技术领域

本发明涉及一种双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌的构建方法与应用，特别涉及一种双启动子Psrf-Pcry3Aa自诱导型重组枯草芽孢杆菌的构建方法及其在制备海藻糖中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

海藻糖是一种非还原性二糖，分子式是C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O，广泛分布于自然界许多生物细胞中。海藻糖是一种生物应激代谢产物，一些在极端环境生长的古生物、真菌，以及一些生长在不良环境中的动植物细胞中海藻糖含量较高。在生物细胞中其功能是保护细胞质膜，蛋白质、核酸等大分子空间结构和功能活性，维持渗透压和防止细胞内营养成分流失。由于海藻糖具有以上功能，它可用于医学生物制品中起到保护剂的作用；增强农作物抗逆性，通过转基因手段来培育耐盐碱型农作物，培育抗冻果蔬等；同时，海藻糖不具有还原性，不会发生美拉德反应，可以作为稳定的添加剂应用于食品行业。因此，对海藻糖进行研究具有重要的意义。

中国专利文献CN105861536A(申请号201610246849.6)公开了一种重组载体，在穿梭质粒pMA5HpaII的两个酶切位点EcoRI和KpnI之间插入ComQ ComX基因，在两个酶切位点BamHI和MluI之间插入通过重叠PCR将Psrf启动子基因、Tat型信号肽PhoD基因和海藻糖合成酶基因TreS连接起来的连接片段。

上述技术的应用建立在枯草芽孢杆菌菌株的基础上，枯草芽孢杆菌在自然界中分布极其广泛，与人类关系非常密切，已成为革兰氏阳性细菌研究的安全模式菌株之一。枯草芽孢杆菌有多种转录表达系统，其中该技术应用的Psrf启动子为枯草芽孢杆菌产表面活性剂的细胞密度诱导型的转录表达系统，无需添加任何诱导剂的诱导，即为枯草芽孢杆菌典型的自诱导型启动子之一。其机理主要在于细菌群体密度增加时，通过相应增加ComX和CSF信息素的表达来激活调节ComP-ComA双组份调节系统，从而磷酸化的ComA激活表面活性素的启动子Psrf，促使其启动子后面的基因转录表达表面活性素。

Pcry3Aa启动子来源于苏云芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)，启动表达的cry3Aa蛋白是苏云芽孢杆菌产生的一种对昆虫具有特异毒性的杀虫晶体蛋白，在营养生长阶段表达较弱，然而在进入稳定期的开始阶段被高度激活表达，在稳定期阶段也持续被表达。Pcry3Aa启动子在枯草芽孢杆菌中被营养生长期的sigma因子σ^A所特异性识别转录，不依赖于枯草芽孢杆菌的稳定期阶段的产芽孢sigma因子以及其它蛋白因子的调控。同时该启动子的激活不要求特别的培养条件、特别的诱导剂和其它压力因素等。因此，Pcry3Aa启动子可作为在枯草芽孢杆菌营养生长期和稳定期表达外源蛋白优选的自诱导启动子之一。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(RDPE)为新型的非经典分泌蛋白，来源于瘤胃球菌(Ruminococcus sp)，该分泌蛋白没有信号肽序列，不需要经过Sec型和Tat型的复杂的分泌途径，目的蛋白与该非经典分泌蛋白的融合分泌效率高达50％以上，同时将近83％的目的蛋白与该分泌蛋白融合达到了分泌效果。本发明技术利用该分泌蛋白跟海藻糖合成酶的融合，通过双自诱导型启动子的表达转录系统，可达到目的蛋白的高效分泌的效果，具有重要的研究意义。

发明内容