[发明专利]一种基于宿主-肠道微生物互作基因的猪粪便污染特异性分子标记1-38及其检测方法

说明书

本发明涉及猪粪便污染物检测领域，尤其涉及一种基于宿主‑肠道微生物互作基因的猪粪便污染特异性分子标记1‑38及其检测方法。本发明采用竞争性杂交基因片段富集方法（GFE）富集猪特异性宏基因组，构建宏基因文库，对文库进行序列菌群及功能分类，从而靶向筛选了宿主（猪）‑肠道微生物互作靶点有关特异性基因，并针对猪特异性互作基因设计分子标记，建立了灵敏度高、特异性强并能高效指示粪便污染源的监测方法。

技术领域

本发明涉及猪粪便污染物检测领域，尤其涉及一种基于宿主-肠道微生物互作基因的猪粪便污染特异性分子标记1-38及其检测方法。

背景技术

猪肉制品作为深受国内消费者喜爱的肉制品之一，其庞大的需求量导致生猪产业迅猛发展。据农业部统计，我国生猪出栏量近年来一直占世界第一，占比维持在56％左右，并保持增长态势。由于缺乏对迅猛发展的集约化畜禽养殖业排放的有效管理，猪等畜禽粪便及其污水多以非点源的方式进入环境，引发污染并诱发健康威胁。猪粪便排泄物中不仅含有大量的病原微生物菌(戊型肝炎病毒、沙门氏菌(Salmonella)、李斯特菌(Listeria)、空肠弯曲菌(Campylobacter spp.)，直接威胁到人类健康，而且含有氮，磷等物质，未经有效处理任意排放，会造成土壤，地下水，地表水及灌溉水的污染，并使水体富营养化，进而导致水产品蓄积大量的有害物质，影响水产品品质。因此，建立一种灵敏度高、特异性强并能高效指示粪便污染源的监测方法显得尤为迫切。

有研究从宿主粪便源菌群如厚壁菌门(Frimicutes)、双歧杆菌属(Bifidobacteria spp)、史氏产甲烷杆菌(Methanobrevibacter smithii)等的16S rRNA和毒力基因等筛选标签来判别污染来源。目前已鉴定的猪特异性分子标记大多基于猪肠道优势菌16S rRNA的保守区。也有从粪便中线粒体DNA、大肠埃希菌中筛选毒力基因[来判断猪粪便污染来源。然而，尽管上述特异性分子标记具有一定的特异性和灵敏性，但存在较大的局限性：1)宿主特异性不够高，2)不同宿主间存在交叉反应性，3)有地理地域差异性，4)判别动物来源的精确性不够高，因此会带来较高的错判率。

肠道微生物群落与其宿主是共同进化的，经宿主和肠道微生物之间强烈选择和协同进化可形成宿主-微生物相互作用的对宿主有益的功能保留区(互作靶点)，这些互作靶点是形成肠道微生物多样性及特异性的重要因素。因此越来越多的研究从人、牛、鸡等的肠道微生物群落中筛选宿主-微生物互作基因作为宿主特异性分子标记，并证明此类分子标记具有较高的特异性和灵敏性。然而，目前尚未见以宿主-微生物互作基因作为特异性分子标记进行水体或食品中猪粪便非点源污染示踪的相关研究。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的一个目的是提供一种基于宿主-肠道微生物互作基因的猪粪便污染特异性的分子标记1-38，本发明的另外一个目的是提供采用上述的分子标记1-38的检测方法，本发明针对猪特异性互作基因设计分子标记，建立了灵敏度高、特异性强并能高效指示粪便污染源的监测方法。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种基于宿主-肠道微生物互作基因的猪粪便污染特异性分子标记1-38，其该分子标记由以下的引物和探针构成：

上游引物：GGAGGTGGTTAAGCCGATATGTT

下游引物：GCCCCTTTCTTGATACTTTGGA

探针：Fam-AAACTGATTGGAGAAGAATACAGGCG-Tam。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：