[发明专利]一种突变α‑乳清蛋白表达载体、制备方法及其应用

权利要求书

1.一种突变α-乳清蛋白表达载体，其特征在于，所述突变α-乳清蛋白表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种突变α-乳清蛋白表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，在pET30a质粒中插入人源α-乳清蛋白的基因片段，构建出pET30a-HLA质粒，所述人源α-乳清蛋白的基因片段如SEQ ID NO.2所示；

步骤2，pET30a-HLA质粒的突变

步骤2.1，设计用于制备pET30a-HLA表达载体的引物Mu-F1和Mu-R1，并分别对引物Mu-F1和Mu-R1的5’端进行磷酸化修饰；

Mu-F1的序列为：

5’-TCAGTCAAGGAACATCGCTGACATCTCCTGTGAC-3’；

Mu-R1的序列为：

5’-ATGTTCCTTGACTGAGGGACCTGGCTGCTCTTGC-3’；

步骤2.2，采用步骤2.1的引物Mu-F1和Mu-R1，并利用点突变试剂盒将pET30a-HLA质粒中人源α-乳清蛋白的基因片段的第73位半胱氨酸对应的TGT序列突变为丙氨酸对应的GCT序列，同时在人源α-乳清蛋白的基因片段的第71位氨基酸和第72位氨基酸之间依次插入ATT、CAG、TCA、AGG和AAC，得到突变后的PCR产物；

步骤2.3，回收突变后的PCR产物，并将突变后的PCR产物进行自身连接反应，回收得到突变α-乳清蛋白表达载体。

3.根据权利要求1所述的突变α-乳清蛋白表达载体在制备HAMLET中的应用。

4.一种利用权利要求1所述的突变α-乳清蛋白表达载体制备HAMLET的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)，将所述突变α-乳清蛋白表达载体转入大肠杆菌感受态细胞BL21中，进行突变α-乳清蛋白的表达，并收集含有突变α-乳清蛋白的BL21菌体沉淀；

步骤(2)，加1×PBS缓冲液重悬BL21菌体沉淀，移入容器中，放在冰上30min，超声破菌直至液体清亮，离心，收集菌体碎片沉淀；

步骤(3)，用GuMCAC-0缓冲液重悬菌体碎片沉淀，室温放置2-4h，然后于4℃，16000-18000g离心30min，收集上清，得到含有突变α-乳清蛋白的溶液，然后进行突变α-乳清蛋白复性，得到复性蛋白溶液；

每升GuMCAC-0缓冲液由以下组分制成：20mmol的Tris-HCl，0.5mol的NaCl，6mol的盐酸胍，100ml的甘油，余量为去离子水，用浓HCl调pH至7.9；

步骤(4)，HAMLET的制备

步骤(4.1)，将复性蛋白溶液以10-15ml/h的流速过金属镍螯合柱；

步骤(4.2)，用MCAC-0冲洗金属镍螯合柱，流速为20-30ml/h；

步骤(4.3)，以10-15ml的油酸溶液冲洗金属镍螯合柱，流速为10-20ml/h，然后静置2-4h，最后用10ml的MCAC-0冲洗金属镍螯合柱；

步骤(4.4)，分段洗脱：分别取10ml下列缓冲液，并依次采用下列缓冲液洗金属镍螯合柱：MCAC-20，MCAC-40，MCAC-60，MCAC-80，MCAC-100，MCAC-200，MCAC-500，且流速均为10-20ml/h，并收集MCAC-100的冲洗液和MCAC-200的冲洗液；

其中，每升MCAC-0由以下组分制成：8mmol的Na₂HPO₄，137mmol的NaCl，2mmol的KH₂PO₄，2.7mmol的KCl，20mmol的Tris-HCl，50ml的甘油，余量为去离子水，用浓HCl调pH至6.8；

每升MCAC-500由以下组分制成：8mmol的Na₂HPO₄，137mmol的NaCl，2mmol的KH₂PO₄，2.7mmol的KCl，20mmol的Tris-HCl，50ml的甘油，0.5mol的咪唑，余量为去离子水，用浓HCl调pH至6.8；

MCAC-200由MCAC-0和MCAC-500按3∶2的体积比例混合而成；MCAC-100由MCAC-0和MCAC-200按1∶1的体积比例混合而成；MCAC-80由MCAC-0和MCAC-100按1∶4的体积比例混合而成；MCAC-60由MCAC-0和MCAC-80按3∶4的体积比例混合而成；MCAC-40由MCAC-0和MCAC-80按1∶1的体积比例混合而成；MCAC-20由MCAC-0和MCAC-40按1∶1的体积比例混合而成；

步骤(4.5)，将MCAC-100的冲洗液或者MCAC-200的冲洗液加入第一透析袋中，然后将第一透析袋置于溶解缓冲液中，4℃透析24-28h，得到HAMLET透析液，其中溶解缓冲液为20mmol/L的pH＝8.0的Tris-HCl溶液；

步骤(4.6)，将HAMLET透析液真空冷冻干燥，得到HAMLET。