[发明专利]一种突变α‑乳清蛋白表达载体、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种突变α-乳清蛋白表达载体、制备方法及其应用。

背景技术

HAMLET(Humanα-Lactalbumin Made Lethal to Tumor Cells)是一种以人源α乳清蛋白为主要成分、可导致肿瘤大量死亡的复合物。HAMLET最初在人乳抑菌效应的研究被偶然发现，继而被证实为一种对肿瘤细胞有强烈杀伤作用的效应分子。在使用不同细胞系的研究中发现HAMLET具有选择性诱导转化细胞、部分胚胎细胞和淋巴细胞发生凋亡的效应，而对成熟的分化细胞没有显著的毒性作用。进一步的研究表明HAMLET具有广谱的抗肿瘤作用，能够杀伤超过40种不同组织来源的肿瘤细胞系。在动物在体模型和临床预试验中，HAMLET对人神经胶质瘤，皮肤乳头状瘤及膀胱癌等均有较好的疗效，且无明显的毒副作用。鉴于HAMLET在肿瘤治疗中的潜在临床应用前景，当前的HAMLET研究开始关注其结构特点，诱导肿瘤细胞死亡的机制以及其规模化生产流程的优化等方面。

目前，HAMLET的结构已经明确，主要由人源α-乳清蛋白(Humanα-Lactalbumin，HLA)与油酸(oleic acid C18：1，OA)按一定比例复合而成。HLA结构研究已经很清楚了，它是由123氨基酸组成的分子量14.2kDa酸性钙结合蛋白，主要有两个结构域：一个大的α-螺旋结构域包含4个α-螺旋(5-11，23-34，86-98和106-110氨基酸)和一个由3个β-折叠组成的结构域(41-43，48-50和55-56氨基酸)。通过钙离子结合环(氨基酸K79，D82，D84，D87和D88)连接这两个结构域，并通过四个二硫键(氨基酸6-12，61-77，73-91和28-111)形成结构稳定的球形蛋白。但是，这种天然状态的HLA只有失去Ca²⁺后形成熔球态结构的apo-HLA，才能与油酸结合形成HAMLET。二个二硫键(61-77，73-91)的存在对于钙离子结合环的形成和熔球态的α乳清蛋白是形成HAMLET的关键成份。

现有的通过离子交换层析柱和金属镍螯合柱制备HAMLET的方法，原核表达含his标签的rHLA蛋白，经NTA金属镍螯合柱纯化后，再经EDTA去除钙离子得到apo-rHLA，透析后的apo-rHLA在NTA金属镍螯合柱上与水溶性油酸结合，最终形成HAMLET。这种方法中，由于EDTA对NTA金属镍螯合柱清洗作用，增加了突变α-乳清蛋白的生产步骤，又增加了蛋白变性、降解的风险，容易导致HAMLET制备失败。

发明内容

本发明的目的是提供一种突变α-乳清蛋白表达载体、制备方法及其应用，解决了现有的通过离子交换层析柱和金属镍螯合柱制备HAMLET的方法中，由于EDTA对NTA金属镍螯合柱清洗作用，增加了突变α-乳清蛋白的生产步骤，又增加了蛋白质变性、降解的风险，容易导致HAMLET制备失败的问题。

本发明提供了一种突变α-乳清蛋白表达载体，所述突变α-乳清蛋白表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种突变α-乳清蛋白表达载体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在pET30a质粒中插入人源α-乳清蛋白的基因片段，构建出pET30a-HLA质粒，所述人源α-乳清蛋白的基因片段如SEQ ID NO.2所示；

步骤2，pET30a-HLA质粒的突变

步骤2.1，设计用于制备pET30a-HLA表达载体的引物Mu-F1和Mu-R1，并分别对引物Mu-F1和Mu-R1的5’端进行磷酸化修饰；

Mu-F1的序列为：

5’-TCAGTCAAGGAACATCGCTGACATCTCCTGTGAC-3’；

Mu-R1的序列为：

5’-ATGTTCCTTGACTGAGGGACCTGGCTGCTCTTGC-3’；

步骤2.2，采用步骤2.1的引物Mu-F1和Mu-R1，并利用点突变试剂盒将pET30a-HLA质粒中人源α-乳清蛋白的基因片段的第73位半胱氨酸对应的TGT序列突变为丙氨酸对应的GCT序列，同时在人源α-乳清蛋白的基因片段的第71位氨基酸和第72位氨基酸之间依次插入ATT、CAG、TCA、AGG和AAC，得到突变后的PCR产物；

步骤2.3，回收突变后的PCR产物，并将突变后的PCR产物进行自身连接反应，回收得到突变α-乳清蛋白表达载体。