[发明专利]一种细胞膜靶向H2S荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于硫化氢检测的荧光探针及其制备方法。首先发烟硫酸与4‑氨基‑1,8‑萘二甲酸酐反应，所得产物在对其几乎不溶的溶剂乙醇中以悬浊液方式与十六胺回流，所得产物仍为悬浊液；将固体收集并溶于水，冰浴下与亚硝酸钠作用，析出的固体悬浮于甲醇中，低温约‑40℃下滴加叠氮化钠的甲醇溶液，低温反应数小时，即得到3‑磺酸(钠)‑5‑叠氮‑1,8‑萘二甲酰亚胺。本发明探针具有能够靶向标记在细胞膜表面的性能，具有独特的溶解性，使探针不会跨过细胞膜进入到细胞里面，只嵌入在细胞膜上，可以检测内源性H₂S。探针本身具有较弱的荧光，在生理条件下可选择性地与H₂S反应，生成具有较强荧光的衍生产物，不受生物体和环境中常见物质以及生物介质背景的干扰。

技术领域

本发明涉及一种通过荧光成像来检测细胞中H₂S释放的细胞膜靶向荧光探针及其制备方法和应用，属于生物检测技术领域。

背景技术

H₂S是最新发现的第三种内源性气体信号分子，它参加了对神经系统、心血管系统、代谢、消化系统、红细胞功能、泌尿生殖系统的调节，同时还可以清除活性氧和活性氮物种，在生命活动中不可或缺。目前可用于检测H₂S的方法有：比色法、电化学分析、色谱分析、金属硫化物沉淀等方法，但这些方法都不能像荧光探针检测法一样实现对活细胞和组织中H₂S的时空分布与快速检测。近些年来，根据荧光探针与H₂S的反应类型如还原反应、亲核加成、硫化物沉淀、间二硝基苯醚硫解反应、模拟硒酶氧化还原等发明了一系列以萘酰亚胺、香豆素、荧光素、罗丹明、近红外区荧光类含双光子染料为母体荧光团的荧光探针。然而，这些探针都是标记在细胞内部，通过荧光强度的改变来实现对细胞内H₂S的检测。作为内源性气体信号分子，H₂S可以自由通过细胞膜，实现细胞间的信号传递和起到生理调节作用。现有的荧光探针都不能对细胞内释放到细胞外这一部分H₂S进行检测。因此，设计合成一种细胞膜靶向H₂S荧光探针，用于实时原位检测从细胞内释放出来的H₂S，对研究H₂S的在生物体内的信号转导途径、生理病理调节具有非常重要的指导意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够靶向标记在细胞膜外表面的细胞膜靶向H₂S 荧光探针，来实现对由细胞内释放到胞外的H₂S的检测，实现H₂S跨膜释放的实时监测。

本发明提供的技术方案具体如下：

一种细胞膜靶向H₂S荧光探针，具有式(I)所示的结构：

其中，R ₁为-SO₃H或-SO₃Na；R₂为C₈～C₁₆直链烷基，荧光团为萘二酰亚胺。

在R₁位置上引入水溶性基团，可以防止萘二酰亚胺及叠氮基团穿过细胞膜进入细胞内，在R₂位置上的长链疏水端可插入细胞膜，使探针仅对细胞膜进行靶向性标记，实现对释放到细胞外的H₂S的检测。

一种制备上述细胞膜靶向荧光探针的方法，包括以下步骤：

(1)将发烟硫酸加入到化合物A(4-氨基-1,8-萘二甲酸酐)中，40～120℃下搅拌反应0.5～3 小时，反应结束后，冷却至室温，先加入冰水，再加入氯化钠进行搅拌，形成悬浊液；过滤，收集沉淀，依次用少量水、大量无水乙醇和大量乙醚洗涤，真空干燥，得橘红色粉末状的化合物B；所述化合物A的结构式为所述化合物B的结构式为