[发明专利]一种热启动DNA聚合酶、制备方法及其应用在审
申请号: | 201610849001.2 | 申请日: | 2016-09-23 |
公开(公告)号: | CN107868774A | 公开(公告)日: | 2018-04-03 |
发明(设计)人: | 刘喜朋 | 申请(专利权)人: | 上海紫众生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N9/12 | 分类号: | C12N9/12;C12N15/10 |
代理公司: | 上海新天专利代理有限公司31213 | 代理人: | 张宁展 |
地址: | 200240 上海市*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 启动 dna 聚合 制备 方法 及其 应用 | ||
技术领域
本发明涉及一种热启动DNA聚合酶的制备方法及其应用,属于基因工程技术领域。
背景技术
基于耐高温DNA聚合酶的PCR反应是一种有着众多应用的常规分子生物学技术。各种耐高温DNA聚合酶大大提高了PCR效率,简化了PCR操作,使PCR广泛应用于各种DNA检测与基因工程领域。耐高温DNA聚合酶的酶促反应活性在高温条件下最高,然而低温条件下,其也有一定活性,会在低温下催化DNA聚合反应的进行。特别是在PCR中稍低于退火温度时,当引物3’端少数几个碱基与非扩增目标区的模板DNA序列发生配对时,耐高温DNA聚合酶低温下的聚合酶活性会延伸这些发生非特异性配对的引物,最终导致DNA非特异性扩增条带的产生。为了解决普通PCR中的耐高温DNA聚合酶低温下导致的非特异性扩增难题,开发了将DNA聚合酶活性在低温时封闭的各种方法,只有达到一定温度,才激活DNA聚合酶活性。目前常用的方法主要有两种:基于DNA聚合酶抗体或DNA聚合酶抑制剂的封闭方法。前者通过在DNA聚合酶中加入其抗体来封闭聚合酶活性。低温下聚合酶活性被抗体封闭,温度升高后抗体蛋白失活,与DNA聚合酶发生分离,聚合酶活性被释放出来。基于DNA聚合酶抑制剂的封闭方法未见详细说明,推测抑制剂共价结合于聚合酶活性的必需氨基酸上。抑制剂低温稳定,可以抑制聚合酶活性;高温分解,不再抑制聚合酶活性。基于聚合酶抗体的封闭效果并不理想,不能完全阻止DNA聚合酶在低温下的活性;而且需要制备昂贵的抗体,加之抗体制备操作繁琐、制备量有限,所以基于抗体的热启动DNA聚合酶应用效果较差。基于抑制剂的热启动DNA聚合酶需要将昂贵的温敏抑制剂共价修饰DNA聚合酶,操作复杂,存在修饰不彻底(聚合酶活性未被完全封闭)等缺点。
发明内容
本发明的目的在于针对现有热启动DNA聚合酶制备技术的不足,提供一种新型的热启动DNA聚合酶的制备方法。本发明方法操作简便、成本低。得到的热启动DNA聚合酶热启动效果好、通用性强。
为实现这样的目的,本发明采用如下的技术方案。
本发明提供一种热启动DNA聚合酶的制备方法,其采用dU修饰寡核苷酸为DNA聚合酶抑制剂,由DNA聚合酶和dU修饰寡核苷酸室温下混合制备得到。
本发明中,所述dU修饰寡核苷酸呈茎环结构、双链结构或单链结构。
本发明中,所述dU修饰寡核苷酸呈茎环结构时,茎和环的长度均不低于6个碱基对,茎的5’端具有单链区,dU核苷酸位于5’单链区,且dU距离茎的末端为1-6个核苷酸,距离5’端不低于1个核苷酸,进一步优选的,dU距离茎末端的最优值为4或5个核苷酸,距离5’端最优距离为5个核苷酸。
本发明中,所述dU修饰寡核苷酸呈双链结构时,双链区不低于12个碱基对,dU核苷酸位于5’单链区,且dU距离双链末端为1-6个核苷酸,距离5’端不低于1个核苷酸,进一步优选的,dU距离茎末端的最优值为4或5个核苷酸,距离5’端最优距离为5个核苷酸。
本发明中,所述dU修饰寡核苷酸呈单链结构时,长度为12-30个核苷酸,dU核苷酸位于单链中间。
本发明还提供一种上述的制备方法得到的热启动DNA聚合酶。
本发明进一步提供上述热启动DNA聚合酶在PCR技术领域中的应用,PCR过程中加入聚合酶活性激活剂,所述聚合酶活性激活剂为热稳定性UDG。具体的,低温条件下,dU修饰的寡核苷酸与DNA聚合酶紧密结合,95℃热变性后,DNA变成单链状态,DNA聚合酶与dU修饰的寡核苷酸的结合力降低,同时热稳定性UDG切除寡核苷酸上的dU,寡核苷酸不再含有dU核苷酸,因此不能再结合DNA聚合酶,使DNA聚合酶去催化目标核酸序列的PCR,实现DNA聚合酶的热激活与热启动PCR。
本发明与现有的热启动DNA聚合酶制备技术相比有显著的进步,主要有益效果如下:
(1)本发明制备热启动DNA聚合酶时,DNA聚合酶不需要修饰,适用于能够紧密结合dU核苷酸的各种DNA聚合酶,例如Pfu DNA聚合酶,KOD DNA聚合酶,Vent DNA聚合酶等B型DNA聚合酶;同时本发明热启动DNA聚合酶应用广泛,可应用于普通PCR、高特异性PCR、短的重复DNA序列多态性的扩增等。
(2)制备成本低,寡核苷酸探针合成成本远低于抗体蛋白,只有抗体的1/10;
(3)DNA聚合酶封闭方法操作简便、结果稳定,只需要先将dU修饰的寡核苷酸抑制剂在常温下与DNA聚合酶混合;
(4)活性抑制剂通用性强,一种抑制剂可以抑制多种DNA聚合酶活性,不像抗体只能抑制一种DNA聚合酶活性;
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