[发明专利]基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A方法

权利要求书

1.一种基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，该基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A的方法包括以下步骤：

采用化学共沉淀法合成磁性纳米颗粒，采用EDC/NHS法将纳米磁珠的羧基与抗OTA纳米抗体上的氨基偶联，制得用于富集谷物样品中OTA的高偶联比免疫磁珠和参与免疫反应体系的低偶联比免疫磁珠；

利用免疫磁珠富集技术对待测样品进行前处理后，得到低偶联比免疫磁珠和OTA的混合物；

再结合磁珠斑点免疫法，以PVDF膜为固相基质，将OTA-OVA检测抗原点样于PVDF膜基质上，以抗Histag抗体作为对照，封闭处理；

将处理好的PVDF膜投入免疫磁珠和OTA的混合物进行反应，磁珠以抗体标记物的形式参与免疫反应，样品混合物中的游离OTA与膜上的OTA-OVA抗原竞争结合免疫磁珠；

以磁珠在PVDF膜聚集OTA-OVA量的多少判断样品中的OTA含量；

利用免疫磁珠富集技术对待测样品进行前处理方法为：

称取5g粉碎后的谷物样品，加入20mL50％甲醇-PBS，剧烈震荡提取10分钟，离心分离上清，PBS稀释一定比例后加入高偶联比免疫磁珠进行孵育；

磁分离除去上清，用1mLPBS洗涤一次；磁珠重悬于120μLPBS中，90℃水浴10min使抗体变性并洗脱OTA，向洗脱溶液中加入10μg低偶联比的免疫磁珠并充分混合。

2.如权利要求1所述的基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，纳米磁珠与抗OTA纳米抗体偶联方法为：

1mg磁珠用500μLMEST洗涤两次；

400μLMES重悬磁珠后加入0.5mgEDC和0.5mgNHS，置于混匀仪上保持悬浮状态，37℃活化1h；

磁分离去上清，500μLMEST洗涤两次，PBST重悬后加入40μg抗OTA纳米抗体，4℃搅拌反应过夜；

偶联产物与乙醇胺37℃混匀1h；

PBST洗涤3次后加1mLPBST重悬，4℃保存；

将上述制备的免疫磁珠稀释到合适浓度，进行电镜表征和紫外扫描。

3.如权利要求2所述的基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述的MEST为：10mMMES,0.05％Tween20,pH6.0；

所述的MES为：10mM,pH6.0；

所述的PBST为0.01MPBS,0.01％Tween20,pH7.4；

所述的乙醇胺体积比为2％的溶液；

所述PBST洗涤3次后加1mLPBST中，1mL的PBST含0.5％BSA和0.02％NaN₃。

4.如权利要求1所述的基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，磁珠斑点免疫法的建立方法包括：

PVDF膜前处理：

用铅笔在PVDF膜上画出膜反应区；将PVDF膜置于甲醇中浸泡15s后取出，再用超纯水漂洗2min；

将两层滤纸平铺于操作台上，加入3mLPBS，使滤纸润湿，并用干燥的滤纸吸收多余的PBS，使台面与滤纸间无气泡；将用超纯水漂洗处理后的膜放在湿滤纸上，用光滑的玻璃试管在滤纸与膜上滚动，使滤纸与膜间无气泡；

用移液器将3μL检测抗原点在膜反应区的中心位置，静置10秒后放入湿盒中，37℃孵育2h；将膜浸泡于5％脱脂牛奶中封闭1h，用PBST漂洗，晾干，并储存于4℃备用。

5.如权利要求1所述的基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，以磁珠在PVDF膜聚集OTA-OVA量的多少判断样品中的OTA含量方法为：

将封闭好的PVDF膜浸入免疫磁珠-OTA混合液中，在水平摇床上室温反应；取出PVDF膜，PBST洗涤3次，样品中的OTA含量越高，能够与膜上OTA-OVA聚集结合的磁珠量越少；洗去未结合的磁珠，判断结果。