[发明专利]基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A方法

说明书

本发明公开了一种基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A方法，将抗OTA纳米抗体与纳米磁珠结合制备IMB，利用IMB富集谷物中的OTA作为样品前处理方法；再结合斑点免疫法，将OTA‑OVA检测抗原固定在PVDF膜上，磁珠以抗体标记物的形式参与免疫反应，OTA‑OVA与待测物OTA竞争结合抗体，以磁珠是否在PVDF膜聚集来判断检测结果。本发明实现简单、快速的定性检测；该方法无需分析仪器即可裸视读取结果，进而可研发一种新型快速可视化的检测卡专门用于检测谷物中的OTA。

技术领域

本发明属于细菌研究技术领域，尤其涉及一种基于纳米抗体及免疫磁分离检测谷物中赭曲霉毒素A方法。

背景技术

赭曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)是一种由青霉素属和曲霉属的某些菌种产生的真菌毒素，主要污染谷物及其制品，是影响我国食品安全的主要因素之一。因此，开发OTA快速检测法显得尤为重要。真菌毒素是由真菌产生的次级代谢产物，普遍存在于被真菌污染的食品和饲料中。研究表明，真菌毒素可能引发肝、肾等器官病变，如肝炎、肝硬化和肝癌，是影响食品安全的主要因素之一。粮食中常见的真菌毒素有黄曲霉毒素(aflatoxins,AFs)、赭曲霉毒素(ocratoxins,OTs)、呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)、伏马菌素B₁(fumonisin b₁,FB₁)、桔青霉素(citrinin,CIT)等。OTA是一种常见的谷物及谷物制品污染物，具有毒性、肝毒性、免疫毒性等多重毒性作用，被国际癌症研究机构(InternationalAgency ofResearch on Cancer,IARC)将列为2B类致癌物质。基于OTA对人类健康的多重威胁，为了降低通过食物摄入OTA所带来的风险，许多国家、地区及国际组织都对食品中OTA含量制定了严格的限量标准。由于食品在生产、加工、运输、贮藏等各个环节都可能遭受真菌污染，所以为了保障食品安全，我们需要开发一些简单快速的检测方法，用于企业和政府相关部门对产品进行现场筛查。目前，检测OTA的方法主要包括色谱分析、免疫分析、电化学分析。薄层色谱、液相色谱、质谱法等色谱分析方法因其灵敏度、准确度高，被广泛应用于法定检验和方法验证。色谱法需要特定的分析仪器，检测周期长，因而不适用于大量样品的快速筛选。免疫分析则弥补了以上不足，目前，酶联免疫法(enzyme linked immuno sorbentassay,ELISA)、斑点免疫法(dot-enzyme linked immuno sorbent assay,Dot-ELISA)、免疫层析法(immunochromatographic assay,ICA)等方法操作简单、快速，商业化产品众多。虽然免疫法的特异性高，但是由于实际样品复杂多样，检测结果易出现假阳性、假阴性，重复性差，只适用于样品的初步筛选。即便免疫法测定OTA的准确度不高，但是低成本、易操作、速度快的特点使其在商业市场上占有很大优势。因此提高免疫分析方法的准确度，可以进一步扩大该方法在食品分析领域的应用范围。由于快速检测方法的主要目的是节省操作时间和减少操作步骤，而且样品前处理在整个分析过程中所占的时间比重较大，因此优化前处理条件实现快速富集是实现快速检测的有效手段。而且，样品中的杂质、萃取过程中残留的有机溶剂、pH值等条件均会影响抗原与抗体之间的特异性反应。为了提高免疫检测的稳定性，优化样品前处理过程，既能够快速富集样品中的待测物且不影响免疫反应体系，是一种行之有效的解决办法。目前常用的样品前处理方法包括液液萃取、固相萃取、免疫亲和层析、免疫磁珠(Immuno magnetic bead,IMB)富集等。液液萃取成本低、应用广，但是净化不彻底，影响检测准确度。SPE净化彻底、干扰杂志少，但是操作繁琐、耗时较长。免疫亲和层析净化彻底、选择性好，通常与色谱法联用，准确度高，但是成本较高、耗时较长。1993年，研究人员首次报道在双峰驼等驼源性动物的血清中除了完整的抗体之外，还存在许多天然缺失轻链和CH1的新型抗体，即重链抗体(Heavy ChainAntibody,HCAb)，后来陆续发现在护士鲨等软骨鱼体内也存在类似驼源HCAb结构的新抗原受体(NewAntigen Receptor,NAR)，与完整的常规抗体IgG1相比，HCAb(IgG2和IgG3)的重链仅由重链可变区、铰链区和恒定区CH2、CH3构成，而HCAb的抗原结合区则仅由重链可变区组成，克隆重链可变区并经表达后即可获得由重链可变区组成的单域抗体VHH(heavy chain variable of heavy chainantibody,VHH)。VHH的分子量约为15kDa，其晶体结构为直径2.5nm、长4nm的椭球形，因而也被称为纳米抗体(Nanobody,Nb)。与软骨鱼相比，驼源性动物更易于进行免疫等操作，因此目前大部分纳米抗体的研究均采用驼源性动物作为实验对象。重链抗体的VHH与完整抗体的VH序列比对分析结果显示两者在框架区(Framework region,FR)和超变区(Hypervariable region,HVR)具有一定的同源性，主要的区别在于以下两方面：第一，FR2的氨基酸构成：完整抗典型特征是在FR2中含有四个高度保守的、与VL相互作用的关键性疏水性氨基酸(V42、G49、L50和W52，这四个疏水性氨基酸在重链抗体的VHH中则相应进化突变为更小的亲水性氨基酸(F42、E49、R50和G52)，使得VHH具有良好的水溶性并无需与VL形成异二聚体就能保持稳定的结构。根据这一特性，Davies等通过定向突变将人源抗体VH区进行驼源化VHH改造，结果表明驼源化的VH的水溶性和稳定性不仅得到了极大的提高，而且仍然保留了良好的抗原结合能力；第二，互补决定区(complementary determining regions,CDRs)的差别：与完整抗体的VH相比，驼源VHH具有更长CDR1区和CDR3区，完整抗体通过6个CDR区形成抗原结合区，而驼源重链抗体通过进化形成更长的CDR1和CDR3区来弥补轻链的缺失，以提供充足的抗原识别面积。此外，VHH的CDR1和CDR3均含有一个半胱氨酸，易形成分子内二硫键，使得纳米抗体具有更好的稳定性。随着纳米抗体技术在医学诊断、疾病治疗应用上的日渐成熟，研究人员进一步发掘了纳米抗体在食品安全检测上的应用潜力。近年来，纳米抗体在真菌毒素、农药残留等有毒有害物的检测方面发展迅速。Xu等以抗桔青霉素(citrinin,CIT)单克隆抗体为靶标，从羊驼天然库淘选获得抗CIT独特型纳米抗体，并以展示有抗独特型纳米抗体的噬菌体替代人工抗原，建立了检测CIT的间接竞争phage ELISA，IC₅₀为10.9μg/kg，比人工抗原建立的传统ELISA灵敏度(IC₅₀＝102.1μg/kg)提高了9倍；Wang等以抗AFB₁单克隆抗体1C11免疫羊驼并构建噬菌体展示纳米抗体文库，经过多轮淘选获得3株抗独特型纳米抗体并选取灵敏度最好的抗体建立了VHH ELISA，IC₅₀为0.16ng/mL，与AFB₂、AFG₁、AFG₂的交叉反应率分别为90.4％、54.4％、37.7％。除了应用于传统的检测方法，纳米抗体结合新型材料制备生物传感器，并应用于食品安全分析正成为当前的研究热点。Zhu等以纳米金作为信号增强剂包被纳米抗体，制备了一种高灵敏快速检测肉毒梭状芽孢杆菌毒素(Clostridium difficile toxin,Tcd)的电化学免疫传感器，检测限分别为TcdA 0.61pg/mL和Tcd B 0.60pg/mL。