[发明专利]同时定量检测海带生物转化液中小分子降血压肽的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品检测技术和现代仪器分析技术领域，特别涉及同时定量检测海带生物转化液中小分子降血压肽的方法。

背景技术

海洋生物是药物和高附加值食品开发的潜在来源，特别是海带等藻类蛋白质。藻类蛋白质可通过酶解、水解、发酵或者肠胃消化等生物转化过程，得到具有较高营养及药用价值的小分子生物活性肽。目前已有多种活性多肽从藻类蛋白酶解物中鉴别和分离出来，且被研究证实对血管紧张素转换酶（ACE）活性有较强的抑制作用，进而抑制机体内的肾素Ⅰ转变为肾素Ⅱ，从而降低血压。

海带生物转化液中的降血压肽分子量较小且含量较低，从中检测并分离降血压肽成为该研究的技术难点。至今尚无同时实现海带生物转化液中降血压肽的定性定量检测方面的报道。目前世界范围内常用的生物活性多肽检测与分离方法为毛细管电泳法、高效液相色谱法、质谱法、核磁共振法等。其中，毛细管电泳法高效快速、分辨率高，能短时间内实现检测分离，并使分析科学步入纳升（nL）水平，然而，毛细管管径较小，致使光路较短，对特殊检测方法（如紫外吸收光谱法）则灵敏度较低，且易受样品组份干扰，重复性较差；质谱法与核磁共振法稳定性、重现性好，准确性及灵敏度较高，然而二者的样品前处理要求较高，制样繁琐，且仪器昂贵，成本代价较高，不利于普及使用；高效液相色谱法（HPLC）具有检测范围广、灵敏度高等优点，且不受温度和流量变化的影响，价值低廉，易于推广，是世界范围内常用的多肽识别和定量检测技术之一。因此，本发明建立了一种简单、有效且实用的高效液相色谱方法，用以定性、定量检测海带生物转化液中具有降血压功效的小分子活性肽，同时为降血压肽的研究及其深度开发奠定基础。

发明内容

本发明旨在提供一种具有简便快捷、重复性好、精密度高和检测成本低且能同时定量检测海带生物转化液中多种小分子降血压肽的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供同时定量检测海带生物转化液中小分子降血压肽的方法，包括以下步骤：

（1）取对照品，制成对照品溶液，用液相色谱进行检测，得到标准曲线；

（2）海带生物转化液制备：采用商业化蛋白酶混合酶解海带粗蛋白，得到富含小分子肽的海带生物转化液；

（3）采用液相色谱对上述海带生物转化液进行检测，检测条件为：

色谱柱为C18反相柱，流动相A为0.1%vol三氟乙酸-乙腈溶液，流动相B为0.1%vol三氟乙酸-水溶液；

（4）比较样品和对照品的峰图，确定待检海带生物转化液中是否含有小分子降血压肽并定量；

（5）对小分子降血压肽进行结构鉴定和血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性检测。

进一步的，所述步骤（1）中所使用的混合酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或者几种的混合物。

进一步的，所述检测条件中采用梯度洗脱，其洗脱条件按时间分段设定为：0至10 min，流动相A的浓度逐渐由3～6%上升为13～16%，10至17 min逐步上升为20～25%，17至22min继续上升至33～36%，22至23min急剧下降至3～6%；流速为0.5～0.8 mL/min。

进一步的，所述检测条件中柱温为35～50℃，进样量为5～15μL，检测波长为216～220 nm。

依据本方法所得标准品色谱图结果，小分子降血压肽KY、GKY、SKTY、AKY、AKYSY、KKFY、FY、KFKY的出峰时间依次为12.450～12.837 min，12.895～13.230 min，13.692～13.936 min，14.348～14.626 min，19.462～19.734 min，20.938～21.229 min，21.527～22.019min，22.075～23.146min。其标准曲线为：

KY ：A₁=14016C₁+24520，

GKY ： A₂ = 11615C₂-27.146，

SKTY ：A₃=12299C₃+5363.4，

AKY：A₄=12254C₄+8453.4，

AKYSY ： A₅=33296C₅+5410.6，

KKFY ：A₆=13976C₆+2096.7，