[发明专利]驻波干涉显微镜

说明书

本发明涉及一种宽场干涉显微镜，其包括：

—样品保持器，用于在分析位置处保持样品；

—照明器，用于用输入辐射来照射样品，从而促使其发射荧光；

—一对投影系统，布置在所述分析位置的相对侧处，以收集所述荧光的至少一部分并将相应的一对光束指引到光学组合元件的各对输入，其在那里进行光学干涉；

—检测器装置，用于检查从所述组合元件输出的光。

本发明还涉及一种使用此类显微镜的方法。

例如从例如在以下参考文献中更详细地阐述的干涉光激活局部化显微术（iPALM）的领域知道如上文所阐述的显微镜：

http://www.pnas.org/content/106/9/3125.full

http://www.mechanobio.info/topics/methods/super-resolution-microscopy-intro

iPALM技术进而可以被视为常规（非干涉）PALM技术的改进，由此，前者为后者增加了轴向地以及横向地执行分辨率/图像重构的能力。

这可以理解如下：

—在PALM中，通过连续地激励样品中的对象（光可激活荧光团）的空间稀疏子集，引起来自这些不同子集的荧光发射的时间分离来实现横向超分辨率。这些稀疏子集中的每一个内的对象的可分辨性比在整个样品将被一下子成像的情况下大。本质上，通过替代地将集合视为被连续地成像的稀疏子集的累计集体来规避在要尝试同时地对对象的稠密子集进行成像的情况下将预期的分辨率限制衍射效应。促使光可激活荧光团在两步过程中发荧光，由此：

▪ 在预备步骤中，使用所谓的“激活的波长”（或“激活波长”）来促进荧光团从非发射至发射状态；

▪ 在后续步骤中，所谓的“激励的波长”（或“激励波长”）被用来引起已激活荧光团（荧光激励）的辐射“放松”。

针对关于此过程的更多信息，参见例如以下参考文献：

http://www.hindawi.com/journals/isrn/2012/619251/

在iPALM中，通过引入还将允许细轴向/深度（Z）分辨率的机制来使在PALM中实现的横向（XY）超分辨率更进一步。这是通过经由一对相对设置的投影系统（物镜、光学柱）对样品（中的荧光团）进行成像而实现的，所述投影系统（物镜、光学柱）的输出射束被馈送到光学组合元件（具体地，三相射束分离器）中，在那里其进行光学干涉。结果得到的干涉条纹图案将对被成像的对象（荧光团）的轴向（深度）位置（非常）敏感，因为这将影响干涉射束的相对路径长度。通过使用包括用以选择性地着眼于来自组合元件的相位分离输出的多个检测器（例如CCD）的检测器装置，可以有效地将给定条纹图案（以算术方式）“转化”成推导的轴向对象位置；在iPALM中，使用三个不同的检测器（相机）来观察来自组合元件的三个不同输出（相互相移达120°），由此，由这些相机观察到的输出的相对强度将作为轴向荧光团位置的函数以可预测方式改变。

虽然iPALM是有用的技术，但其确实遭受缺点的影响。更具体地，其依赖于相对复杂的光学/检测架构。特别地：

—采用的三相射束分离器是难以制造的昂贵且易碎的组件。其性能对温度波动和机械振动敏感，并且其在被干扰之后具有相对长的建立时间（settling time）。此外，其难以以光学方式对准/调整。

—采用的三相射束分离器还难以在尺寸方面进行机械缩放，例如以匹配具有较大视场的相机（在没有渐晕（vignetting）的情况下）。关于这方面的限制性因素包括射束分离器的平面光学件上的公差以及荧光的相干特性。

—检测机构（set-up）要求使用三个检测器/相机，其增加体积/减小可用空间，并且增加费用。

在正常情况下，应注意的是除PALM/iPALM之外，使用中还存在各种其它类型的荧光显微术（例如，诸如STORM和dSTORM）。可以例如从以下参考文献收集关于这方面的更多信息：

https://en.wikipedia.org/wiki/Super-resolution_microscopy