[发明专利]一种从细胞悬液中提取和纯化包裹药物的细胞囊泡的方法

说明书

本发明提供了一种从细胞悬液中提取和纯化包裹药物的细胞囊泡的方法，包括：1)将细胞悬液过滤，收集滤液；2)将步骤1)收集的滤液离心，收集沉淀，获得包裹药物的细胞囊泡；其中所述的过滤为将所述细胞悬液通过孔径为5μm‑10μm的滤膜或滤芯过滤；所述的离心为以100‑100000g的离心力高速离心；所述的包裹药物的细胞囊泡为凋亡细胞释放的含有肿瘤治疗药的微颗粒，所述的细胞悬液为包含所述细胞、细胞碎片和细胞囊泡的混合液。本发明方法的工艺相对简单，对仪器的损耗较小，没有污染，细胞囊泡的收率高，有利于实现工业化生产，且由该方法获得的包裹药物的细胞囊泡具有更高的含药量和更好的治疗效果。

技术领域

本发明涉及一种从细胞悬液中提取和纯化包裹药物的细胞囊泡的方法。

背景技术

肿瘤是一种严重威胁人类生命的顽疾。近年来，其治疗方法主要有放疗和化疗。然而这两种常规的肿瘤治疗方法，在消除肿瘤细胞的同时，也会杀伤正常组织细胞，损害患者的免疫系统，导致其免疫功能缺陷或下降，大大降低了患者的生存质量，给患者带来难以承受的毒副作用，致使放化疗失败。针对放化疗的毒副作用，人们想到用载体包裹化疗药物的方法，使化疗药物选择性地在肿瘤部位释放，甚至选择性地进入肿瘤细胞内，从而达到选择性杀伤肿瘤细胞的效果。但是外源性载体对生物机体也有一定的毒副作用，同时临床使用的载体颗粒的粒径也使其容易穿过正常细胞的细胞膜，从而增加了载体及其所包裹的化疗药物对机体的毒副作用。

为了克服上述放化疗肿瘤治疗法和采用外源性载体包裹化疗药治疗肿瘤的方法的缺陷，中国专利CN102302784A公开了一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法，该制剂是以源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡为载体，用其包裹肿瘤化疗药制备而成。该制剂直接到达肿瘤部位，提高了化疗药的药效，同时克服了因外源载体给药而对机体产生的毒副作用。CN102302784A还公开了所述肿瘤化疗药物制剂的制备方法，其中采用梯度离心的方法从经肿瘤化疗药物处理的肿瘤细胞培养液中提取纯化含有细胞囊泡和被包裹其中的化疗药的微颗粒(参见CN102302784A说明书实施例1的实验步骤2(3))。具体地，逐步离心肿瘤细胞培养液，取离心后的上清液再离心，即以500rpm、1000rpm、5000rpm的转速各离心10分钟，之后以14000g的离心力离心1分钟，以除去细胞及碎片，再以14000g的离心力离心1小时，获得所述微颗粒。

通过梯度离心的方法可选择性的除去细胞碎片，但同时也会损失掉部分囊泡，从而导致最终收集得到的细胞囊泡的数量减少。并且高速离心时的离心体积较大，会降低梯度离心收集囊泡的效率，使得工业化生产的难度较大，从而不能满足大规模的临床用药。

发明内容

针对梯度离心收集囊泡效率低的问题，本发明的目的在于提供一种从细胞悬液中制备包裹药物的细胞囊泡的方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种从细胞悬液中提取和纯化包裹肿瘤治疗药的细胞囊泡的方法，包括下述步骤：

1)将细胞悬液过滤，收集滤液；

2)将步骤1)收集的滤液离心，收集沉淀，获得包裹药物的细胞囊泡；

其中步骤1)所述的过滤为将所述细胞悬液通过孔径为5μm-10μm的滤膜或滤芯过滤；

步骤2)所述的离心为以100-100000g的离心力高速离心；

其中，所述的细胞悬液的制备方法为：

用化学、物理或生物方法使细胞发生凋亡，将凋亡的细胞与肿瘤治疗药接触，使得所述肿瘤治疗药被包裹进入凋亡的细胞，所述的包裹药物的细胞囊泡为凋亡细胞释放的含有肿瘤治疗药的微颗粒，所述的细胞悬液为包含所述细胞、细胞碎片和细胞囊泡的混合液。

本发明所述的细胞悬液为含有细胞囊泡的细胞培养液，其中所述细胞包括但不限于各种肿瘤细胞和红细胞等。

所述使细胞发生凋亡的方法优选紫外线照射，或者将细胞直接与化疗药物接触，或者将细胞与放射线接触的方法。