[发明专利]用于人EGFR基因突变检测的探针、试剂盒及其检测方法

说明书

本发明涉及基因检测领域，特别涉及用于人EGFR基因突变检测的探针、试剂盒及其检测方法。本发明提供的用于人EGFR基因突变检测的探针，所述探针包括1‑35探针对中的任一种或多种，每个探针对中包括捕获探针和检测探针；1‑35探针对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑70所示。这些探针均是针对人EGFR的热点突变设计，经多次筛选得到，捕获探针与检测探针配合作用，具有灵敏度高，特异性强，结果准确可靠。本发明还提供了人EGFR基因突变检测试剂盒，该试剂盒只需少量检测样本，检测过程利用电场作用，加快反应速率，缩短反应时间，整个检测过程可以在半小时内完成，大大节约检测所需时间，并且检测灵敏度和准确率高。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体而言，涉及用于人EGFR基因突变检测的探针、试剂盒及其检测方法。

背景技术

空气污染等环境因素导致近年来中国肺癌患病人数急剧增加。十万人肺癌发病率从2002年的39.6％增加到2011年的63％，尤其是儿童和青少年的发病率大幅提升。改革开放三十年以来，肺癌导致的死亡人数增加了465％，肺癌在我国已经成为发病率及死亡率均排名第一的恶性肿瘤。按传统的组织病理学分类，肺癌可分小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌(Non-small-cell Lung Cancer，NSCLC)，包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞肺癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚，非小细胞肺癌约占肺癌总数的80-85％。

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是表皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR(ErbB-1),HER2/c-neu(ErbB-2),Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。EGFR属于酪氨酸激酶型受体，EGFR与其配体在胞外区结合后，EGFR分子间形成同二聚体，也可与其他HER家族分子结合形成异二聚体，之后其胞内区的酪氨酸激酶(TK)被激活，酪氨酸残基相互磷酸化，随后其下游偶联蛋白(PLCγ、aCBL、GRB2、SHC、p85)与该磷酸化部位特异性结合，将信号传递到下游的RAS-MAPK通路、PI3K-AKT通路、STAT通路等，从而激活增殖、细胞凋亡逃逸、血管新生、转移等与与肿瘤发生发展密切相关的生物学行为。在包括肺癌在内的各类肿瘤中，频繁发现EGFR基因的过度表达，而且还与预后有关，因此EGFR作为分子靶标倍受瞩目。

研究表明，EGFR突变基因与酪氨酸激酶抑制类药物(tyrosine kinaseinhibitors，TKI)使用有疗效关联，这些药物包括Iressa(易瑞沙)和Tarceva(特罗凯)，EGFR基因突变影响着TKI的临床疗效。EGFR突变主要包括4种类型：外显子19缺失突变、外显子2l点突变、外显子18点突变和外显子20插入突变。目前发现EGFR基因突变90％以上的突变位于外显子19、21，最常见的EGFR突变为外显子19LREA缺失和外显子21L858R突变，二者均会导致酪氨酸激酶结构域活化，且均为TKI的敏感性突变，外显子20的T790M突变与EGFR-TKI获得性耐药有关，还有许多类型的突变临床意义尚不明确。肺腺癌患者EGFR基因敏感突变阳性率在高加索人群约为10％，在亚裔人群和我国均为50％左右。

目前EGFR基因突变检测主要分为肿瘤组织样本的检测以及肿瘤循环DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)的检测。目前，临床上主要通过组织活检或手术等方式获得的肿瘤组织样本来检测EGFR基因突变，但是由于获取肿瘤组织标本需采用侵入性手段，这个过程往往会增加病人的痛苦，产生额外的手术风险，并且肿瘤具有异质性，对于已经发生转移的癌症患者而言，通过穿刺或手术仅仅取某个部位的癌组织，并不能反映患者整体的情况。其次，有些患者自身的情况决定了其不适合组织活检，而有些肿瘤在受到穿刺或手术的扰动之后，有加速转移的风险。最后，组织活检存在费用高等待时间长等诸多问题，其滞后性对患者的治疗也是不利的。