[发明专利]一种双通道蛋白表达的工程酵母的构建方法

权利要求书

1.一种双通道蛋白表达工程酵母的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体的构建：在启动子GAL10的后面依次连接分泌信号肽SS、α-半乳糖苷酶Aga2基因、小鼠LFA-1 αL I domain胞外域和Flag标签，使小鼠LFA-1 αL I domain 胞外域、Flag标签和的α半乳糖苷酶Aga2基因的N端到C端区域，能够展示于酵母细胞EBY100的表面；在启动子GAL1的后面依次连接wGFP荧光蛋白基因和Myc标签，使其能够在酵母细胞的胞内表达wGFP绿色荧光蛋白，用于指示酵母数量，得到双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-mu αL I d-wGFP；分离小鼠LFA-1 αL I domain胞外域基因片段四个，分别为wt、F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G，得到四个双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-muαL Id-wGFP，分别为pDV3-intre-muαLIdwt-wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/T208I -wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/F277L-wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/F277L/F267G –wGFP；所述的启动子GAL10的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述的分泌信号肽SS的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述的α-半乳糖苷酶Aga2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；小鼠LFA-1 αL I domain胞外域为四个，所述的wt、F292S/T208I、F292S/F277L、F292S/F277L/F267G的核苷酸序列分别如SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；所述的Flag标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；所述的启动子GAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，wGFP荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的Myc标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；所述的双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-mu αL I d-wGFP为四个，分别为pDV3-intre-muαL Idwt-wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/T208I -wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/F277L -wGFP、pDV3-intre-muαL Id F292S/F277L/F267G –wGFP，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：12、 SEQ ID NO：13、 SEQ ID NO：14 和SEQ ID NO：15所示；

（2）双通道蛋白表达工程酵母载体的验证：将步骤（1）所述的质粒载体pDV3-intre-muαL I d-wGFP以PEG/LiAc 方法转入酵母细胞EBY100中，得到重组酵母细胞，培养该重组酵母细胞并诱导所述重组载体的表达，得到表面展示有目标蛋白的酵母细胞后，通过流式细胞仪检测小鼠LFA-1 αL I domain和wGFP荧光蛋白是否表达。