[发明专利]一种双通道蛋白表达的工程酵母的构建方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种双通道蛋白表达的工程酵母的构建方法。构建得到一种基因工程酵母质粒载体，该质粒载体携带两个表达外源基因的启动子GAL10和GAL1，其中一个启动子GAL10能够将外源蛋白定位至酵母表面；另外一个启动子GAL1控制的基因的蛋白表达于酵母的细胞质内。本发明的工程酵母能够将两种不同的蛋白通过不同的蛋白表达通道输送到酵母表面或者定位于细胞质内，酵母表面的蛋白可以用于蛋白功能研究，胞内荧光强度指示酵母数量而达到的高效、简便、经济的目的以及用于胞内蛋白研究。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种双通道蛋白表达工程酵母的构建方法，本发明构建得到一种酵母质粒载体，该载体携带两个表达外源基因的启动子GAL10和GAL1，其中启动子GAL10表达的基因与酵母凝集素小亚基融合，由于凝集素小亚基将与定位在酵母表面的凝集素大亚基共价结合，因此将携带外源蛋白一起定位至酵母表面；另外一个启动子GAL1控制的基因，其蛋白表达于酵母的细胞质内。本发明的工程酵母能够将两种不同的蛋白通过不同的蛋白表达通道输送到酵母表面或者定位于细胞质内。

背景技术

酵母表面展示(简称YSD)是将外源蛋白表达于酵母体内并通过酵母表面凝集素将其携带至细胞表面的一种技术(Boder,et al.,1997.)。a型凝集素大亚基Aga1共价连接于酵母表面β-葡聚糖，而小亚基Aga2又与Aga1之间形成两对二硫键。据此，Boder和Wittup等将Aga1蛋白整合到酵母基因组，并用一个质粒载体以Gal1启动子表达Aga2和外源基因的融合蛋白。因此外源基因便以融合蛋白的形式随Aga2转移到酵母表面。由于融合蛋白被共价地展示于细胞表面，可以方便地用外源蛋白的受体或抗体，或置于外源蛋白前或者后的寡肽的通用抗体来检测蛋白的表达，借助常用的流式细胞仪，可快速定量检测外源蛋白与受体间的亲和力。YSD的这些特点，使其能够非常适用于文库筛选，增强蛋白稳定性和表达量，以及定位蛋白功能结构域等。YSD尤其对于无需构建大容量文库的蛋白定向进化非常有效，如利用该技术使蛋白亲和力提高了二十万倍(Jin,M.et al.,2006)。

酵母表面双杂交系统(YS2H)，是通过分泌途径来分析蛋白互作的一个平台，这种系统是在酵母表面展示系统的基础上发展起来的，优点在于无需蛋白表达纯化，在酵母体内同时表达这两个蛋白并最终展示于酵母表面。在YSD基础上酵母表面展示一个外源蛋白X，另一个蛋白Y则以分泌的形式表达，如果X能结合Y，那么Y则可以与X一起附于酵母表面，利用Y或与Y融合的寡肽的抗体来检测他们的亲和性，并且X和Y之间的亲和性可以通过流式细胞仪定量(Hu,.et al.,2009)。这种技术有几个特点：①将Gall和Gall0启动子的联用。②建立利用酵母蛋白分泌途径的蛋白-蛋白相互作用体系。③本系统无需蛋白纯化即可进行蛋白的定向进化以及文库受体筛选。