[发明专利]一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法

权利要求书

1.一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

i.取新生儿新鲜的离体脐带，将其置于控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液中，保存待用；

ii.取出经步骤i处理的脐带，用控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液多次冲洗，至无血迹残留；

iii.在控温为2~5℃的浸泡液环境中，剪切洗涤后的脐带，剪切过程中剔除动静脉；所述脐带和浸泡液的用量比为1g:13ml，所述浸泡液包括1.0g/L的葡萄糖、18g/L的乙醇、0.4g/L的L-谷氨酸，余量为水；

iv.取剪切后的脐带，用控温为2~5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液冲洗2~3次，将其放入培养瓶后置于控温为-80~-70℃且控真空度为10~30Pa的环境下5~20min，除去脐带上的溶剂；

v.取培养瓶密封处理，将其置于控温为-40~-35℃的环境中，待培养瓶的温度升至-40~-35℃时则将培养瓶转移至控温为-5~0℃的环境中，待培养瓶的温度升至-5~0℃时则将培养瓶转移至控温为37℃的环境中，至其内的脐带解冻完全；

vi.取经步骤v处理的培养瓶，于其内加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液；其中所述脐带和PBS液的用量比为1g: 1ml，振荡1~5min使脐带和PBS液充分接触；

vii.取经步骤vi处理的培养瓶，于其内加入第一混合酶溶液，振荡处理，振荡用的水浴控温曲线为：0-5min，15℃恒温→5.01-20min，匀速升温至25℃→20.01-30min，25℃恒温→30.01-40min，匀速升温至37℃→40.01-75min，37℃恒温→75.01-90min，自然冷却至25℃；其中所述脐带和第一混合酶溶液的用量比为1g:4ml，所述第一混合酶溶液包括2mg/g的胰蛋白酶-EDTA消化液、3mg/g的胶原酶II、8mg/g的乙醇，余量为水；

viii.取经步骤vii处理的培养瓶，于其内加入第二混合酶溶液，振荡处理，振荡用的水浴控温曲线为：0-2min，25℃恒温→2.01-10min，匀速升温至30℃→10.01-15min，30℃恒温→15.01-20min，匀速升温至37℃→20.01-60min，37℃恒温→60.01-75min，自然冷却至25℃；其中所述脐带和第二混合酶溶液的用量比为0.5g:3.5ml，所述第二混合酶溶液包括0.8mg/g的胶原酶II、1mg/g透明质酸酶、0.5mg/g的DNA水解酶、5mg/g的乙醇，余量为水；

IX.取经步骤viii处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和0.1g/L链霉素的LG-DMEM培养基，于20~25℃下静置2~5min并在此温度下离心5~8min；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.4ml:1.5ml:4ml；

X.取经步骤IX处理的培养瓶，加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液，于20~25℃下静置2~5min并在此温度下离心5~8min，弃上清；其中所述脐带和PBS液用量比为1g:3ml；

XI.取经步骤X处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基，于20~25℃下静置2~5min并在此温度下离心5~8min，弃上清，重复2~3次；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.5ml:2ml:5ml；

XII.取经步骤XI处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基，混匀；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.5ml:1ml:1ml；

XIII. 取经步骤XII处理后的样品的100μL样品，向其加入0.5ml的胎牛血清、12ml的DMEM/F12培养基和1mg NaCl，置于37℃、体积分数为5%的CO₂、湿度为95%RH的环境中静置培养；4天后换液，去除未贴壁细胞，以后每2天更换一次；待培养皿中的细胞达到80%融合，弃去培养液，PBS漂洗1次后，加37℃、胰蛋白酶-EDTA消化液消化2 min，轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基终止消化，收集吹打后所得细胞，离心，弃上清，用加入0.5ml的胎牛血清、12ml的DMEM/F12培养基和1mg NaCl重新混匀，1∶2的比例进行传代接种，置于37℃、体积分数5%CO₂、湿度为95%RH的环境中静置培养，每2天更换一次换液1次，待培养皿中的原代干细胞达到80%融合用同样方法消化传代；

所述步骤IX 、步骤XI、步骤XII和步骤XIII中，LG-DMEM培养基的基础培养基包括1000mg/L的葡萄糖、4.0mM的L-谷氨酸、110mg/L丙酮酸钠、25mM的HEPES。