[发明专利]一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法

说明书

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，该分离和培养方法包括以下步骤：新生儿新鲜的离体脐带→低温PBS液保存、冲洗→低温浸泡液中剪切→低温PBS液冲洗，低温真空处理→解冻→加入PBS液浸润→加入第一混合酶溶液，振荡酶解处理→加入第二混合酶溶液，振荡酶解处理→加入胎牛血清、PBS液、LG‑DMEM培养基，静置后离心，弃上清→加入PBS液，静置后离心，弃上清→加入胎牛血清、PBS液、LG‑DMEM培养基，静置后离心，弃上清→加入胎牛血清、PBS液、LG‑DMEM培养基，混匀→扩增培养；具有提高脐带间充质干细胞纯度的效果。

技术领域

本发明涉及间充质干细胞的制备技术，特别涉及一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，其可在体外适宜条件下连续传代培养、冻存。由于MSCs在特定条件下可分化为不同细胞，故其逐渐成为细胞治疗和基因治疗领域中极具实用价值的细胞来源。脐带属于胚胎外组织，其含有大量多向分化的干细胞，细胞生长扩增速度快，且脐带在胎儿娩出后成为“废弃物”，所以取材方便，来源丰富，更无伦理学问题，可作为极佳的间充质干细胞来源。

公开号为CN101643719A、公开日为2010年2月10日的中国专利公开了一种简化的脐带间充质干细胞分离培养方法，该方法包括下述步骤：脐带去除生理盐水清洗→剪切→离心弃上清→组织块用10％αMEM培养，每3天换液→至10天左右细胞达80％左右融合时传代→以后每隔3-5天传代一次。

在细胞表型鉴定研究发现，通过这种方法分离培养得到的脐带间充质干细胞纯度仍有待提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，具有提高脐带间充质干细胞纯度的效果。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：

i.取新生儿新鲜的离体脐带，将其置于控温为2～5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液中，保存待用；

ii.取出经步骤i处理的脐带，用控温为2～5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液多次冲洗，至无血迹残留；

iii.在控温为2～5℃的浸泡液环境中，剪切洗涤后的脐带，剪切过程中剔除动静脉；所述脐带和浸泡液的用量比为1g:10～20ml，所述浸泡液包括0.9～1.0g/L的葡萄糖、10～20g/L的乙醇，余量为水；

iv.取剪切后的脐带，用控温为2～5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液冲洗2～3次，将其放入培养瓶后置于控温为-80～-70℃且控真空度为10～30Pa的环境下5～20min，除去脐带上的溶剂；

v.取培养瓶密封处理，将其置于控温为-40～-35℃的环境中，待培养瓶的温度升至-40～-35℃时则将培养瓶转移至控温为-5～0℃的环境中，待培养瓶的温度升至-5～0℃时则将培养瓶转移至控温为37℃的环境中，至其内的脐带解冻完全；

vi.取经步骤v处理的培养瓶，于其内加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液；其中所述脐带和PBS液的用量比为1g:0.5～1ml，振荡1～5min使脐带和PBS液充分接触；