[发明专利]口蹄疫病毒样颗粒在作为重组质粒运载载体中的应用

权利要求书

1.口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)在制备重组质粒运载载体中的应用，所述的口蹄疫病毒样颗粒为O型口蹄疫VLPs，所述的O型口蹄疫VLPs由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1组装而成，其中VP1的基因序列为SEQ ID NO.1所示，VP3的基因序列为SEQ ID NO.2所示，VP0的基因序列为SEQ ID NO.3所示，所述的重组质粒为DNA疫苗。

2.一种口蹄疫病毒VLPs/DNA疫苗复合物，其特征在于以O型口蹄疫VLPs作为载体，所述的O型口蹄疫VLPs内包被有含有Asia1型口蹄疫病毒编码基因的重组质粒，所述的含有Asia1型口蹄疫病毒编码基因的重组质粒是将Asia1型口蹄疫病毒的P1-2A和3C片段串联构建到真核表达载体上得到的；所述的O型口蹄疫VLPs由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1组装而成，其中VP1的基因序列为SEQ ID NO.1所示，VP3的基因序列为SEQ ID NO.2所示，VP0的基因序列为SEQ ID NO.3所示。

3.如权利要求2所述的口蹄疫病毒VLPs/DNA疫苗复合物，其特征在于所述的Asia 1型口蹄疫病毒毒株为Asia1/Jiangsu/China/2005，所述的真核表达载体为pcDNA3.1(+)。

4.如权利要求2所述的口蹄疫病毒VLPs/DNA疫苗复合物，其特征在于所述的重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.一种构建权利要求2所述的口蹄疫病毒VLPs/DNA疫苗复合物的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体pSMA以及pSMK的构建：

a.以酿酒酵母基因组DNA为模板，以smt3F与smt3R为引物扩增smt3基因，引物序列如下：

smt3F：5’GCCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCAA3’，

smt3R：5’GGATCCGAGACCTTAAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG 3’，

b.经NcoI和BamHI双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pET-28a载体中，所得载体为pSMK，将pSMK的卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因，得载体pSMA；

(2)口蹄疫结构蛋白基因重组表达载体的构建

根据已公布的GenBank登陆号为JN998085.1的O型口蹄疫病毒的序列，进行密码子优化并合成结构蛋白基因VP0，VP3和VP1；以合成的基因为模板，以下引物对分别扩增VP0，VP3和VP1基因片段：

VP1F：5’GGTCTCTAGGTACCACCAGCACGGGCGAA 3’

VP1R：5’CGCGGATCCTCACAGACTTTGTTTGACCGG 3’

VP0F：5’GGTCTCTAGGTGGTGCGGGCCAGTCATCTCC 3’

VP0R：5’CGCGGATCCTCATTCTTTACTCGGAAATTC 3’

VP3F：5’GGTCTCTAGGT GGTATCTTCCCGGTGGCGTG 3’

VP3R：5’CGCGGATCCTCA TTGCTGACGGGCATCAACC 3’

采用聚合酶链式反应方法，分别用引物VP1F/VP1R、VP3F/VP3R和VP0F/VP0R扩增获得VP1、VP3和VP0基因片段；扩增得到的VP1、VP3和VP0基因片段分别经BsmBI/BamH I双酶切后插入经BsaI酶切处理的pSMK或pSMA，所构建重组表达载体分别命名为pSMK/VP0，pSMK/VP1和pSMA/VP3，以pSMK/VP1为模板，以T7BamHI/VP1XhoI为引物扩增获得含T7启动子和VP1基因的DNA片段，经BamHI/XhoI双酶切后插入用同样酶切处理的pSMK/VP0中，所得双表达重组载体命名为pSMK/VP0-VP1；所述T7BamHI/VP1XhoI引物序列为：

T7BamHI：5’GCAATTGGATCCCGTCCGGCGTAGAGGATCGA 3’

VP1XhoI：5’GCGCACCTCGAGTCACAGAGTCTGTTTCTCAGG 3’

(3)衣壳蛋白的表达及纯化

将表达载体pSMA/VP3和pSMK/VP0-VP1共转化到表达菌BL21(DE3)，用卡那霉素和氨苄青霉素筛选阳性克隆进行蛋白表达和纯化；

(4)含有Asia1型口蹄疫病毒编码基因的重组质粒pcDNA3.1/P12A3C的构建

根据已公布的GenBank登陆号为EF149009的Asia1型口蹄疫病毒的序列，分别设计包含酶切位点的P1-2A和3C引物，以Asia1型口蹄疫病毒的基因组为模板，分别扩增含酶切位点KpnI和EcoRI的P1-2A片段和含酶切位点EcoRI和XhoI的3C片段，先用KpnI/EcoRI双酶切P1-2A片段和pcDNA3.1(+)载体，连接构建重组载体pcDNA3.1/P1-2A，再用EcoRI/XhoI双酶切3C片段和pcDNA3.1/P1-2A重组载体，连接转化获得重组质粒，命名为pcDNA3.1/P12A3C，扩增P1-2A和3C所用引物序列如下：

P12AKpnI：5’ATGGGTACCATGGGAGCCGGGCAATCCAGTCCGGCGA 3’

P12AEcoRI：5’ACGGAATTCGTTTGACCTGACATCAGAGAAGAAG 3’

3CEcoRI：5’ACGGAATTCGTGAAGAAGCCTGTCGCTTTGAA 3’

3CXhoI：5’AGCCTCGAGCTACTCGTGGTGTGGTTCGGGGTCGAT 3’

经酶切鉴定和测序正确后，提取质粒备用；

(5)VLPs-质粒复合物的包装

将纯化得到的O型口蹄疫病毒结构蛋白和携带Asia 1型衣壳编码基因P1-2A和非结构蛋白3C基因的质粒pcDNA3.1/P12A3C加入透析袋中，同时加入小泛素样修饰蛋白酶，并置于含有500mM NaCl，pH8.0的20mM Tris-HCl组装缓冲液中，在4℃组装过夜，得到VLPs-质粒复合物，即为所述的口蹄疫病毒VLs/DNA疫苗复合物。