[发明专利]口蹄疫病毒样颗粒在作为重组质粒运载载体中的应用有效
申请号: | 201610929291.1 | 申请日: | 2016-10-31 |
公开(公告)号: | CN107029226B | 公开(公告)日: | 2020-07-03 |
发明(设计)人: | 郭慧琛;孙世琪;郜原;靳野;魏衍全;张韵;刘湘涛;李杰林;马军武;冯霞 | 申请(专利权)人: | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
主分类号: | A61K39/135 | 分类号: | A61K39/135;A61K48/00;A61P31/14 |
代理公司: | 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司 11139 | 代理人: | 孙皓晨;马鑫 |
地址: | 730046 甘肃*** | 国省代码: | 甘肃;62 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 口蹄疫病毒 颗粒 作为 重组 质粒 运载 载体 中的 应用 | ||
1.口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)在制备重组质粒运载载体中的应用,所述的口蹄疫病毒样颗粒为O型口蹄疫VLPs,所述的O型口蹄疫VLPs由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1组装而成,其中VP1的基因序列为SEQ ID NO.1所示,VP3的基因序列为SEQ ID NO.2所示,VP0的基因序列为SEQ ID NO.3所示,所述的重组质粒为DNA疫苗。
2.一种口蹄疫病毒VLPs/DNA疫苗复合物,其特征在于以O型口蹄疫VLPs作为载体,所述的O型口蹄疫VLPs内包被有含有Asia1型口蹄疫病毒编码基因的重组质粒,所述的含有Asia1型口蹄疫病毒编码基因的重组质粒是将Asia1型口蹄疫病毒的P1-2A和3C片段串联构建到真核表达载体上得到的;所述的O型口蹄疫VLPs由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1组装而成,其中VP1的基因序列为SEQ ID NO.1所示,VP3的基因序列为SEQ ID NO.2所示,VP0的基因序列为SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求2所述的口蹄疫病毒VLPs/DNA疫苗复合物,其特征在于所述的Asia 1型口蹄疫病毒毒株为Asia1/Jiangsu/China/2005,所述的真核表达载体为pcDNA3.1(+)。
4.如权利要求2所述的口蹄疫病毒VLPs/DNA疫苗复合物,其特征在于所述的重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.一种构建权利要求2所述的口蹄疫病毒VLPs/DNA疫苗复合物的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体pSMA以及pSMK的构建:
a.以酿酒酵母基因组DNA为模板,以smt3F与smt3R为引物扩增smt3基因,引物序列如下:
smt3F:5’GCCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCAA3’,
smt3R:5’GGATCCGAGACCTTAAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG 3’,
b.经NcoI和BamHI双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pET-28a载体中,所得载体为pSMK,将pSMK的卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因,得载体pSMA;
(2)口蹄疫结构蛋白基因重组表达载体的构建
根据已公布的GenBank登陆号为JN998085.1的O型口蹄疫病毒的序列,进行密码子优化并合成结构蛋白基因VP0,VP3和VP1;以合成的基因为模板,以下引物对分别扩增VP0,VP3和VP1基因片段:
VP1F:5’GGTCTCTAGGTACCACCAGCACGGGCGAA 3’
VP1R:5’CGCGGATCCTCACAGACTTTGTTTGACCGG 3’
VP0F:5’GGTCTCTAGGTGGTGCGGGCCAGTCATCTCC 3’
VP0R:5’CGCGGATCCTCATTCTTTACTCGGAAATTC 3’
VP3F:5’GGTCTCTAGGT GGTATCTTCCCGGTGGCGTG 3’
VP3R:5’CGCGGATCCTCA TTGCTGACGGGCATCAACC 3’
采用聚合酶链式反应方法,分别用引物VP1F/VP1R、VP3F/VP3R和VP0F/VP0R扩增获得VP1、VP3和VP0基因片段;扩增得到的VP1、VP3和VP0基因片段分别经BsmBI/BamH I双酶切后插入经BsaI酶切处理的pSMK或pSMA,所构建重组表达载体分别命名为pSMK/VP0,pSMK/VP1和pSMA/VP3,以pSMK/VP1为模板,以T7BamHI/VP1XhoI为引物扩增获得含T7启动子和VP1基因的DNA片段,经BamHI/XhoI双酶切后插入用同样酶切处理的pSMK/VP0中,所得双表达重组载体命名为pSMK/VP0-VP1;所述T7BamHI/VP1XhoI引物序列为:
T7BamHI:5’GCAATTGGATCCCGTCCGGCGTAGAGGATCGA 3’
VP1XhoI:5’GCGCACCTCGAGTCACAGAGTCTGTTTCTCAGG 3’
(3)衣壳蛋白的表达及纯化
将表达载体pSMA/VP3和pSMK/VP0-VP1共转化到表达菌BL21(DE3),用卡那霉素和氨苄青霉素筛选阳性克隆进行蛋白表达和纯化;
(4)含有Asia1型口蹄疫病毒编码基因的重组质粒pcDNA3.1/P12A3C的构建
根据已公布的GenBank登陆号为EF149009的Asia1型口蹄疫病毒的序列,分别设计包含酶切位点的P1-2A和3C引物,以Asia1型口蹄疫病毒的基因组为模板,分别扩增含酶切位点KpnI和EcoRI的P1-2A片段和含酶切位点EcoRI和XhoI的3C片段,先用KpnI/EcoRI双酶切P1-2A片段和pcDNA3.1(+)载体,连接构建重组载体pcDNA3.1/P1-2A,再用EcoRI/XhoI双酶切3C片段和pcDNA3.1/P1-2A重组载体,连接转化获得重组质粒,命名为pcDNA3.1/P12A3C,扩增P1-2A和3C所用引物序列如下:
P12AKpnI:5’ATGGGTACCATGGGAGCCGGGCAATCCAGTCCGGCGA 3’
P12AEcoRI:5’ACGGAATTCGTTTGACCTGACATCAGAGAAGAAG 3’
3CEcoRI:5’ACGGAATTCGTGAAGAAGCCTGTCGCTTTGAA 3’
3CXhoI:5’AGCCTCGAGCTACTCGTGGTGTGGTTCGGGGTCGAT 3’
经酶切鉴定和测序正确后,提取质粒备用;
(5)VLPs-质粒复合物的包装
将纯化得到的O型口蹄疫病毒结构蛋白和携带Asia 1型衣壳编码基因P1-2A和非结构蛋白3C基因的质粒pcDNA3.1/P12A3C加入透析袋中,同时加入小泛素样修饰蛋白酶,并置于含有500mM NaCl,pH8.0的20mM Tris-HCl组装缓冲液中,在4℃组装过夜,得到VLPs-质粒复合物,即为所述的口蹄疫病毒VLs/DNA疫苗复合物。
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