[发明专利]口蹄疫病毒样颗粒在作为重组质粒运载载体中的应用

说明书

本发明公开了口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)在作为重组质粒运载载体中的应用。本发明尝试将口蹄疫VLPs作为质粒运载载体，应用其潜在的运载能力和控释特性，将Asia1型口蹄疫病毒重组质粒成功运载并能在动物体内释放，最终刺激机体产生有效免疫应答反应。结果显示，口蹄疫VLPs可以运载质粒DNA进入细胞并有效释放，在注射进动物体内后，能够有效释放承载的外源质粒DNA，最终诱导特异的抗体免疫反应和显著的T‑淋巴细胞免疫反应。这些结果表明，VLPs可以作为载体运载质粒进入细胞并成功释放，且能在动物机体内有效刺激机体产生特异的免疫反应。本发明为扩展口蹄疫VLPs的生物学应用进行了一次新的尝试和创新。

技术领域

本发明涉及一种口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)的新用途，特别涉及口蹄疫病毒样颗粒在作为重组质粒运载载体中的应用。本发明属于农业科学畜牧兽医科学技术领域。

背景技术

DNA疫苗是近年来发展起来的一种新型疫苗，它是一种表达某种抗原基因的真核表达质粒，该质粒表达的蛋白在细胞内合成、加工、递呈的过程与完整病毒很相似，能够诱导较强的免疫反应和保护力，而且比传统疫苗具有安全、稳定、更容易构建和生产等优点。因此，目前DNA疫苗已经成为国际疫苗研究领域中的热点，并己在人和动物的多种传染病、寄生虫病以及肿瘤治疗等方面取得进展。实现DNA疫苗有效免疫的前提条件之一是能够将重组质粒DNA运载到细胞内，目前作为质粒DNA的载体有病毒载体及非病毒载体，前者包括腺病毒、痘病毒等，后者主要包括多聚物，如鲑鱼精蛋白、多溶素、PEG、PLA、多聚糖以及以惰性基质材料为主的无机纳米颗粒。但由于这些载体或多或少存在缺陷，其优化还在进行中，为了寻找更有效、更具生物相容性的质粒DNA载体，近年来出现的病毒样颗粒(VLPs)引起了研究者的关注。VLPs是一类形态结构与自然病毒粒子相似的生物形式，主要由病毒的单个或多个衣壳蛋白构成。由于其不携带病毒遗传物质，不具有感染性；它作为纳米级生物载体，有较大的体表面积，可承载大量外源物质；具有比合成材料更优越的生物相容性，几乎对生物组织没有毒性，且容易降解。因此，目前VLPs在呈递药物和运载外源小分子等方面表现出独特的优势。

本发明初次尝试将口蹄疫病毒VLPs作为质粒DNA载体进行应用，并进行了一系列验证和条件摸索，证实口蹄疫病毒VLPs能成功运载外源质粒DNA，这为口蹄疫病毒VLPs作为疫苗应用之外，进一步扩展了其生物应用范围，也为DNA疫苗的成功应用，提供了新的优势载体。

发明内容

为了有效运载质粒DNA，寻找更具生物安全性和生物相容性的载体，本发明充分利用VLPs的优势，尝试以口蹄疫病毒VLPs作为质粒DNA运载载体，通过体外、细胞内、动物体内的试验验证，确定了口蹄疫病毒VLPs能够成功运载质粒DNA，为DNA免疫提供了新的载体选择。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明利用口蹄疫病毒VLPs承载质粒DNA，通过体外复合物的稳定性研究、细胞内质粒DNA的释放观察以及动物体内特异免疫反应的检测等，证实口蹄疫病毒VLPs能够有效承载质粒DNA，并实现外源质粒DNA的生物功能。

在上述研究的基础上，一方面，本发明提出了口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)在制备重组质粒运载载体中的应用，优选的，所述的重组质粒为DNA疫苗。

另一方面，本发明还提出了一种口蹄疫病毒VLPs/DNA疫苗复合物，所述的DNA疫苗以O型口蹄疫VLPs作为载体，所述的O型口蹄疫VLPs内包被有含有Asia1型口蹄疫病毒编码基因的重组质粒，所述的含有Asia1型口蹄疫病毒编码基因的重组质粒是将Asia1型口蹄疫病毒的P1-2A和3C片段串联构建到真核表达载体上得到的。

在本发明中，优选的，所述的O型口蹄疫VLPs由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1组装而成，其中VP1的基因序列为SEQ ID NO.1所示，VP3的基因序列为SEQ ID NO.2所示，VP0的基因序列为SEQ ID NO.3所示。