[发明专利]一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法

说明书

本发明提供了一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，该方法利用包埋有量子点的荧光微球替代常规的酶载体与赭曲霉毒素A偶联，以偶联产物作为竞争抗原执行直接竞争ELISA。在技术路线中，本发明首先依据发光特性选择了适宜的量子点，进一步设计了基于荧光微球技术的量子点包埋方法，在此基础上，将量子点荧光微球经BSA包被后与赭曲霉毒素A偶联，从而得到了性能更好的竞争性抗原。该技术方案中，荧光微球通过高聚物载体包埋了大量的量子点，因而具有更高的发光强度，可有效地提高检测的灵敏度；而且，由于荧光微球具有较大的粒径，因此可在一定程度上降低竞争抗原与包被抗体之间过高的亲和力，从而提升检测的灵敏度。

技术领域

本发明涉及抗原检测技术领域，进一步涉及基于荧光免疫学分析的抗原检测技术，具体涉及一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法。

背景技术

赭曲霉毒素是一个被世界广为关注的毒素，它是由曲霉属和青霉属的霉菌产生的一组毒性代谢产物，包括A、B、C等7种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A的毒性最大。一般容易受到赭曲霉毒素污染的食品包括：大豆、绿豆、咖啡豆、酒、葡萄汁、调味品、草本植物、猪肾等。国际癌症研究机构将其定位2B类致癌物。赭曲霉毒素A具有很强的肾毒性，对动物的肾脏和肝脏危害最大。除特异性肾毒性以外，赭曲霉毒素A还具有致畸、致突变、致癌作用和免疫毒性，也可造成肠炎、淋巴坏疽、肝肿大等疾病。动物试验表面，赭曲霉毒素A可以累计在家畜禽体内，通过食物链对人类健康造成威胁，通过赭曲霉毒素A喂养大白鼠可引起肝癌和肾癌，此外，母亲经膳食摄入的赭曲霉毒素A可分泌至乳汁中从而影响下一代因此建立超灵敏的检测方式检测赭曲霉毒素A对人类健康有着非常重要的意义。

基于免疫学的快速筛查方法因具有通量高、检测快速、成本低等优势，近年来得到广泛的推广和应用。其中竞争酶联免疫吸附法在小分子抗原的检测中扮演了重要角色，常规竞争酶联免疫吸附法采用辣根过氧化物酶催化四甲基联苯胺显色作为信号源，这种简单的催化底物显色作为信号导致了常规竞争酶联免疫吸附法检测范围在μg/mL到ng/mL之间，远远满足不了食品污染检测pg/mL的检测要求。目前，用于提高直接竞争免疫学分析方法检测灵敏度的策略主要有两个方面：一是提高检测信号的灵敏度，如等离子共振免疫吸附法、化学发光免疫吸附法、拉曼散射免疫吸附法及荧光免疫吸附法等；二是降低竞争抗原与抗体的亲和力，如化学合成结构类似物及生物合成模拟表位等。

在传统直接竞争酶联免疫吸附法中，竞争抗原的制备是通过将小分子半抗原与载体蛋白(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)偶联。由于载体蛋白的尺寸较小，导致竞争抗原与相应抗体的亲和力较高，无法被目标物所竞争。相对于载体蛋白，纳米颗粒具有更大的尺寸和重量，在相同的温度下，其布朗运动更慢。使用纳米颗粒作为小分子半抗原的载体可以合成出亲和力更低的竞争抗原，从而更容易被目标分析物竞争，进而获得更高的检测灵敏度。此外，使用纳米材料替代蛋白作为竞争抗原的载体，有效地规避了传统化学合成或生物合成抗原类似物的局限性，如操作复杂繁琐、费时费力以及偶然性大等。基于上述技术优势，纳米颗粒的抗原载体受到了广泛的关注，然而在载体的选择方面，既应当考虑分子层面的偶联效果，同时还应当具有良好的发光特性。近年来，量子点以其宽激发、窄发射、斯托克斯位移大和耐光漂白等优良的光学特性在免疫学分析中得到了广泛应用，有研究者尝试利用量子点代替常规载体HRP、ALP，然而实际研究中发现量子点与抗原的结合效果不理想，相应的发光性能难以保证，同时由于量子点本身性质不稳定，因此易受环境影响而发生荧光淬灭，此外，由于量子点的粒径仍相对较小，因此一方面存在分离纯化不方便的问题，另一方面仍会导致竞争抗原和抗体之间亲和力过高的现象。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对赭曲霉毒素A的灵敏检测方法，以解决现有技术中针对赭曲霉毒素A的检测方法灵敏性较低的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中针对赭曲霉毒素A的直接竞争ELISA法因显色底物发光性能不佳而导致检测灵敏度较低。