[发明专利]基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法及应用有效
| 申请号： | 201610953890.7 | 申请日： | 2016-10-27 |
| 公开（公告）号： | CN106636342B | 公开（公告）日： | 2020-09-08 |
| 发明（设计）人： | 袁灿;彭芳;杨泽茂;张超;钟文娟;杨晓;牟方生;龚一耘;蒲德强;戢沛城;叶霄;熊淼;黄海燕 | 申请（专利权）人： | 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京东正专利代理事务所(普通合伙) 11312 | 代理人： | 张伟朴 |
| 地址： | 610300 四川省*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 川芎 转录 序列 开发 est ssr 标记 引物 获取 方法 应用 | ||
1.一种基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)对川芎转录组测序数据拼接，拼接去冗余得到unigene；
(2)利用MISA软件对拼接到的unigene进行SSR位点发掘；SSR位点发掘时的基本参数设置为：单核苷酸至少重复10次，双核苷酸至少重复6次，三核苷酸至少重复5次，四核苷酸至少重复5次，五核苷酸至少重复5次，六核苷酸至少重复5次；
(3)利用Primer 3.0软件对上述SSR检测结果进行引物设计，得到设计的EST-SSR引物；引物设计时参数设置为：引物长度18-25bp；退火温度52.0-60.0℃，且上游引物和下游引物的Tm值相差不大于5℃；GC含量40％-60％；PCR扩增产物长度100-300bp；
(4)采用CTAB方法提取川芎的基因组DNA，用设计的EST-SSR引物对川芎DNA进行PCR扩增，然后进行毛细管电泳，根据电泳结果数据筛选出EST-SSR标记引物组，采用该方法制备的引物组包括74对引物，其中各引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：148所示。
2.根据权利要求1所述的基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，其特征在于，步骤(4)中，PCR扩增的反应体系为：DNA 2μL、5U·μL-1Taq酶0.2μL、10mmol·L-1引物2μL、2.5mmol·L-1dNTP 2μL、25mM 10×Buffer 2μL、ddH2O 11.8μL。
3.根据权利要求1所述的基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法，其特征在于，步骤(4)中，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸6min。
4.权利要求1所述的基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法获取的引物组在川芎种质资源遗传多样性分析中的应用。
5.权利要求1所述的基于川芎转录组序列开发的EST-SSR标记引物组的获取方法获取的引物组在鉴定川芎品种中的应用。
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